Определение возможных микроРНК-маркеров злоупотребления препаратами кобальта методом ПЦР в реальном времени с использованием панелей сигнального пути гипоксии

Цели. Кобальт имитирует состояние гипоксии, препятствуя деградации альфасубъединицы гипоксия-индуцируемого фактора, что приводит к увеличению кислородной емкости крови и может использоваться спортсменами в качестве допинга для получения конкурентных преимуществ. На сегодняшний момент для определения общего кобальта в организме используют прямые методы масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, жидкостной хроматографиитандемной масс-спектрометрии, однако Всемирным антидопинговым агентством не установлена максимально допустимая пороговая концентрация этого элемента в биожидкостях. Отсутствие четких критериев идентификации осложняет интерпретацию полученных результатов. В связи с этим, в данной статье впервые предлагается подход по косвенному определению возможных злоупотреблений кобальтом для целей допинг-контроля, основанный на изменении уровней экспрессии микроРНК, задействованных в регуляции сигнального пути гипоксии. Цель исследования заключалась в поиске возможных микроРНК-маркеров, экспрессия которых не зависит от гипоксии, вызванной физическими нагрузками, но заметно изменяется при приеме препаратов кобальта.
Методы. Выделение микроРНК из образцов плазмы крови проводили при помощи набора PAXgene Blood miRNA Kit. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на амплификаторе CFX96 Bio-Rad (США) с помощью наборов miScript® SYBR® Green PCR Kit и панелей для исследования профилей экспрессии зрелых микроРНК сигнального пути гипоксии Hypoxia Signaling Pathway miScript® miRNA PCR Array.
Результаты. На основании статистического анализа данных было установлено, что экспрессия hsa-miR-15b-5p в плазме крови испытуемых не зависит от физической нагрузки, но возрастает при приеме препаратов кобальта.
Выводы. Разница в уровнях экспрессии при гипоксии, вызванной анаэробной физической нагрузкой, и имитацией гипоксии за счет применения кобальта делает hsa-miR-15b-5p потенциальным претендентом на роль маркера злоупотребления данным эритропоэзстимулирующим агентом.

1. Robinson J.C., James III G.W., Kark R.M. The effect of oral therapy with cobaltous chloride on the blood of patients suffering with chronic suppurative infection. New Engl. J. Med. 1949;240(19):749–753. https://doi.org/10.1056/NEJM194905122401902

2. Ebert B., Jelkmann W. Intolerability of cobalt salt as erythropoietic agent. Drug Test. Anal. 2014;6(3):185–189. https://doi.org/10.1002/dta.1528

3. Pronina I.V., Mochalova E.S., Efimova Yu. A., Postnikov P.V. Biological functions of cobalt and its toxicology and detection in anti-doping control. Tonk. Khim. Tekhnol. = Fine. Chem. Technol. 2021;16(4):318–336 (Russ., Eng.). https://doi.org/10.32362/2410-6593-2021-16-4-318-336

4. Hoffmeister T., Schwenke D., Wachsmuth N., Krug O., Thevis M., Byrnes W.C., Schmidt W.F.J. Erythropoietic effects of low-dose cobalt application. Drug Test Anal. 2019;11(2):200–207. https://doi.org/10.1002/dta.2478

5. Beuck S., Schanzer W., Thevis M. Hypoxia-inducible factor stabilizers and other small-molecule erythropoiesis- stimulating agents in current and preventive doping analysis. Drug Test. Anal. 2012;4(11):830–845. https://doi.org/10.1002/dta.390

6. Muñoz-Sánchez J., Chánez-Cárdenas M.E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J. Appl. Toxicol. 2019;39(4):556–570. https://doi.org/10.1002/jat.3749

7. Finley B.L., Monnot A.D., Paustenbach D.J., Gaffney S.H. Derivation of a chronic oral reference dose for cobalt. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2012;64(3):491–503. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2012.08.022

8. Gault N., Sandre C., Poncy J.-L., Moulin C., Lefaix J.-L., Bresson C. Cobalt toxicity: chemical and radiological combined effects on HaCaT keratinocyte cell line. Toxicol. in Vitro. 2010;24(1):92–98. https://doi.org/10.1016/j.9tiv.2009.08.027

9. Catalani S., Rizzetti M.C., Padovani A., Apostoli P. Neurotoxicity of cobalt. Hum. Exp. Toxicol. 2012;31(5):421–437. https://doi.org/10.1177/0960327111414280

10. Gómez-Arnaiz S., Tate R.J., Grant M.H. Cytotoxicity of cobalt chloride in brain cell lines – a comparison between astrocytoma and neuroblastoma cells. Toxicol. in Vitro. 2020;68:104958. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2020.104958

11. Jelkmann W. Efficacy of recombinant erythropoietins: Is there unity of international units? Nephrol. Dial. Transpl. 2009;24(5):1366–1368. https://doi.org/10.1093/ndt/gfp058

12. Krug O., Kutscher D., Piper T., Geyer H., Schänzer W., Thevis M. Quantifying cobalt in doping control urine samples – a pilot study. Drug Test. Anal. 2014;6(11–12):1186–1190. https://doi.org/10.1002/dta.1694

13. Ho E.N.M., Chan G.H.M., Wan T.S.M., Curl P., Riggs C.M., Hurley M.J., Sykes D. Controlling the misuse of cobalt in horses. Drug Test. Anal. 2015;7(1):21–30. https://doi.org/10.1002/dta.1719

14. Thevis M., Krug O., Piper T., Geyer H., Schanzer W. Solutions Advertised as Erythropoiesis-stimulating Products were Found to Contain Undeclared Cobalt and Nickel Species. Int. J. Sports Med. 2016;37(1):82–84. https://doi.org/10.1055/s-0035-1569350

15. Knoop A., Görgens C., Geyer H., Thevis M. Elevated urinary cobalt concentrations identified in routine doping controls can originate from vitamin B12. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2020;34(7):e8649. https://doi.org/10.1002/rcm.8649

16. Sobolevsky T., Ahrens B. Measurement of urinary cobalt as its complex with 2-(5-chloro-2-pyridylazo)- 5-diethylaminophenol by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the purpose of anti-doping control. Drug Test. Anal. 2021;13(6):1145–1157. https://doi.org/10.1002/dta.3004

17. Minakata K., Suzuki M., Suzuki O. Application of electrospray ionization tandem mass spectrometry for the rapid and sensitive determination of cobalt in urine. Anal. Chim. Acta. 2008;614(2):161–164. https://doi.org/10.1016/j.aca.2008.03.043

18. Hillyer L.L., Ridd Z., Fenwick S., Hincks P., Paine S.W. Pharmacokinetics of inorganic cobalt and a vitamin B12 supplement in the Thoroughbred horse: differentiating cobalt abuse from supplementation. Equine Vet. J. 2018;50(3):343–349. https://doi.org/10.1111/evj.12774

19. Postnikov P.V., Ordzhonikidze Z.G., Badtieva V.A., Turin I.A., Pavlov V.I. Determination of cobalt in plasma blood samples by the ICP-MS method after oral intake of low doses of Co-containing dietary supplements. Voprosy pitaniia = Problems of Nutrition. 2022;91(6):100–109.

20. Hoffmeister T., Schwenke D., Krug O., Wachsmuth N., Geyer H., Thevis M, Byrnes W.C., Schmidt W.F.J. Effects of 3 Weeks of Oral Low-Dose Cobalt on Hemoglobin Mass and Aerobic Performance. Front. Physiol. 2018;9:1289. https://doi.org/10.3389/fphys.2018.01289

21. Postnikov P.V., Efimova Yu. A., Pronina I.V. Circulating MicroRNAs as a New Class of Biomarkers of Physiological Reactions of the Organism to the Intake of Dietary Supplements and Drugs. Microrna. 2022;11(1):25–35. http://dx.doi.org/10.2174/2211536611666220422123437

22. Пронина И.В., Постников П.В., Павлов В.И., Орджоникидзе З.Г. Сравнение профилей экспрессии микроРНК атлетов, выступающих в видах спорта, ориентированных на выносливость, и добровольцев, не занимающихся спортом, с использованием панели сигнального пути гипоксии. Спортивная медицина наука и практика. 2022;12(2):13–21. https://doi.org/10.47529/2223-2524.2022.2.10

23. Sessa F., Salerno M., Di Mizio G., Bertozzi G., Messina G., Tomaiuolo B., Pisanelli D., Maglietta F., Ricci P., Pomara C. Anabolic Androgenic Steroids: Searching New Molecular Biomarkers. Front. Pharmacol. 2018;9:1321. https://doi.org/10.3389/fphar.2018.01321

24. Leuenberger N., Saugy M. Circulating microRNAs: The Future of Biomarkers in Anti-doping Field. In: Santulli G. (Ed.). MicroRNA: Medical Evidence. Advances in Experimental Medicine and Biology. 2015;888:401–408. https://doi.org/10.1007/978-3-319-22671-2_20

25. Guo X.-Y., Liu Q.-L., Liu W., Cheng J.-X., Li Z.-J. Effect and mechanism of miR-135a-5p/CXCL12/JAK-STAT axis on inflammatory response after myocardial infarction. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2020;24(24):12912–12928. https://doi.org/10.26355/eurrev_202012_24195

26. Yin N., Zhu L., Ding L., Yuan J., Du L., Pan M., Xue F., Xiao H. MiR-135-5p promotes osteoblast differentiation by targeting HIF1AN in MC3T3-E1 cells. Cell. Mol. Biol. Lett. 2019;24:51. https://doi.org/10.1186/s11658-019-0177-6

27. Zhang Z., Ren L., Zhao Q., Lu G., Ren M., Lu X., Yin Y., He S., Zhu C. TRPC1 exacerbate metastasis in gastric cancer via ciRS-7/miR-135a-5p/TRPC1 axis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2020;529(1):85–90. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.05.181

28. Li Y., Peng B., Li Y., Huang A., Peng Y., Yu Q., Li Y. MiR-203a-3p/153-3p improves cognitive impairments induced by ischemia/reperfusion via blockade of SRC-mediated MAPK signaling pathway in ischemic stroke. Chem. Biol. Interact. 2022;358:109900. https://doi.org/10.1016/j.cbi.2022.109900

29. Huang H., Dong H., Zhang J., Ke X., Li P., Zhang E., Xu G., Sun B., Gao Y. The Role of Salivary miR-134-3p and miR-15b-5p as Potential Non-invasive Predictors for Not Developing Acute Mountain Sickness. Front. Physiol. 2019;10:898. https://doi.org/10.3389/fphys.2019.00898