Способ получения рекомбинантных антител, продуцируемых клеточной линией, трансдуцированной рекомбинантными аденовирусами

Цели. Разработать технологию получения рекомбинантных антител в суспензионной культуре клеток человека HEK293 с помощью трансдукции рекомбинантными аденовирусами человека пятого серотипа, несущими гены, экспрессирующие тяжелые и легкие цепи антител, на примере двух противогриппозных антител широкого спектра действия 27F3 и CR9114.
Методы. Рекомбинантные аденовирусы Ad5-27F3-H, Ad5-CR9114-H и Ad5-27F3-L, несущие ген тяжелой цепи антитела 27F3, ген тяжелой цепи антитела CR9114 и ген легкой цепи 27F3, были получены с помощью набора AdEasy™ Adenoviral vector system. Для накопления препаративных количеств рекомбинантных антител r27F3 и rCR9114 суспензионную клеточную линию HEK293 трансдуцировали рекомбинантными аденовирусами, несущими гены тяжелых и легких цепей антител, и культивировали клетки в биореакторе волнового типа. Рекомбинантные антитела очищали из культуральной жидкости хроматографическим методом. Молекулярную массу полученных антител анализировали с помощью белкового электрофореза, их способность взаимодействовать с вирусами гриппа А и В методом вестерн-блот анализа, а способность нейтрализовать вирусы гриппа А и В с помощью реакции вирус-нейтрализации.
Результаты. Отработана методика накопления и очистки рекомбинантных антител r27F3 и CR9114 из культуральной жидкости суспензионной культуры клеток человека после трансдукции ее рекомбинантными аденовирусами, несущими гены тяжелых и легких цепей этих антител. Показана способность антитела r27F3 взаимодействовать с вирусами гриппа А подгруппы 1 (кроме вируса грипп А субтипа H2) и подгруппы 2 и нейтрализовать их. Показана способность антитела rCR9114 взаимодействовать с вирусами гриппа А подгруппы 1 и вирусами гриппа В, а также нейтрализовать вирусы гриппа А подгруппы 1.
Выводы. Отработана технология получения рекомбинантных антител в суспензионной культуре клеток HEK293 с помощью трансдукции рекомбинантными аденовирусами, несущими гены, экспрессирующие тяжелые и легкие цепи антител, и показана их специфичность.

1. Kaplon H., Chenoweth A., Crescioli S., Reichert J.M. Antibodies to watch in 2022. MAbs. 2022 Jan-Dec. 2022;14(1):2014296. https://doi.org/10.1080/19420862.2021.2014296

2. Kumar R., Parray H.A., Shrivastava T., Sinha S., Luthra K. Phage display antibody libraries: A robust approach for generation of recombinant human monoclonal antibodies. Int. J. Biol. Macromol. 2019;135:907–918. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.06.006

3. Альтшулер Е.П., Серебряная Д.В., Катруха А.Г. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности. Успехи биологической химии. 2010;50:203–258. URL: https://www.fbras.ru/wp-content/uploads/2017/10/Altschuler.pdf

4. Yu J., Guo Y., Gu Y., Fan X., Li F., Song H., Nian R., Liu W. A novel silk fibroin protein-based fusion system for enhancing the expression of nanobodies in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2022;106(5–6):1967–1977. https://doi.org/10.1007/s00253-022-11857-7

5. Garvey M. Non-mammalian eukaryotic expression systems yeast and fungi in the production of biologics. J. Fungi (Basel). 2022;8(11):1179. https://doi.org/10.3390/jof8111179

6. Vazquez-Lombardi R., Nevoltris D., Luthra A., Schofield P., Zimmermann C., Christ D. Transient expression of human antibodies in mammalian cells. Nat. Protoc. 2019;13:99–117. https://doi.org/10.1038/nprot.2017.126

7. Korn J., Schäckermann D., Kirmann T., Bertoglio F., Steinke S., Heisig J., Ruschig M., Rojas G., Langreder N., Wenzel E.V., Roth K.D.R., Becker M., Meier D., van den Heuvel J., Hust M., Dübel S., Schubert M. Baculovirus-free insect cell expression system for high yield antibody and antigen production. Sci Rep. 2020;10(1):21393. https://doi.org/10.1038/s41598-020-78425-9

8. Huang Y.M., Hu W., Rustandi E., Chang K., Yusuf-Makagiansar H., Ryll T. Maximizing productivity of CHO cell-based fed-batch culture using chemically defined media conditions and typical manufacturing equipment. Biotechnol. Prog. 2010;26(5):1400–1410. https://doi.org/10.1002/btpr.436

9. Gupta K., Parasnis M., Jain R., Dandekar P. Vectorrelated stratagems for enhanced monoclonal antibody production in mammalian cells. Biotechnol. Adv. 2019;37(8):107415. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.107415

10. Jäger V., Büssow K., Wagner A., Weber S., Hust M., Frenzel A., Schirrmann T. High level transient production of recombinant antibodies and antibody fusion proteins in HEK293 cells. BMC Biotechnol. 2013;13:52. https://doi.org/10.1186/1472-6750-13-52

11. Kim T.K., Eberwine J.H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal. Bioanal. Chem. 2010;397(8):3173–3178. https://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6

12. Croset A., Delafosse L., Gaudry J.P., Arod C., Glez L., Losberger C., Begue D., Krstanovic A., Robert F., Vilbois F., Chevalet L., Antonsson B. Differences in the glycosylation of recombinant proteins expressed in HEK and CHO cells. J. Biotechnol. 2012;161(3):336–348. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2012.06.038

13. Tan E., Chin C.S.H., Lim Z.F.S., Ng S.K. HEK293 Cell Line as a Platform to Produce Recombinant Proteins and Viral Vectors. Front. Bioeng. Biotechnol. 2021;9:796991. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.796991

14. König J., Hust M., van den Heuvel J. Validation of the Production of Antibodies in Different Formats in the HEK293 Transient Gene Expression System. Methods Mol. Biol. 2021;2247:59–76. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1126-5_4

15. Рябова Е.И., Деркаев А.А., Есмагамбетов И.Б., Щебляков Д.В., Довгий М.А., Бырихина Д.В., Прокофьев В.В., Чемоданова И.П. Сравнение различных технологий получения рекомбинантного аденоассоциированного вируса в лабораторном масштабе. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021;21(4):266–278. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2021-21-4-266-278

16. Greber U.F., Gomez-Gonzalez A. Adenovirus – a blueprint for gene delivery. Curr. Opin. Virol. 2021;48:49–56. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2021.03.006

17. Lang S., Xie J., Zhu X., Wu N.C., Lerner R.A., Wilson I.A. Antibody 27F3 broadly targets influenza A group 1 and 2 hemagglutinins through a further variation in VH1-69 antibody orientation on the HA stem. Cell Rep. 2017;20(12):2935–2943. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.08.084

18. Dreyfus C., Laursen N.S., Kwaks T., Zuijdgeest D., Khayat R., Ekiert D.C., Lee J.H., Metlagel Z., Bujny M.V., Jongeneelen M., van der Vlugt R., Lamrani M., Korse H.J., Geelen E., Sahin Ö., Sieuwerts M., Brakenhoff J.P., Vogels R., Li O.T., Poon L.L., Peiris M., Koudstaal W., Ward A.B., Wilson I.A., Goudsmit J., Friesen R.H. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 2012;337(6100):1343–1348. https://doi.org/10.1126/science.1222908

19. Tutykhina I., Esmagambetov I., Bagaev A., Pichugin A., Lysenko A., Shcherbinin D., Sedova E., Logunov D., Shmarov M., Ataullakhanov R., Naroditsky B., Gintsburg A. Vaccination potential of B and T epitope-enriched NP and M2 against Influenza A viruses from different clades and hosts. PLoS One. 2018;13(1):e0191574. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191574

20. Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я. Краткий курс практической вирусологии. М.: Медгиз; 1954. 272 с.

21. Грибова И.Ю., Тиллиб С.В., Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Верховска Л.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Эффективная экспрессия наноантител рекомбинантным аденовирусным вектором in vitro. Acta Naturae. 2011;3(3):66–72.

22. Tutykhina I.L., Sedova E.S., Gribova I.Y., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Tillib S.V., Gintsburg A.L. Passive immunization with a recombinant adenovirus expressing an HA (H5)-specific single-domain antibody protects mice from lethal influenza infection. Antiviral. Res. 2013;97(3):318–328. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2012.12.021

23. Щербинин Д.Н., Алексеева С.В., Шмаров М.М., Смирнов Ю.А., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Анализ В-клеточных эпитопов гемагглютинина вирусов гриппа. Acta Naturae. 2016;8(1):13–20. https://doi.org/10.32607/20758251-2016-8-1-13-20

24. Есмагамбетов И.Б., Щебляков Д.В., Егорова Д.А., Воронина О.Л., Деркаев А.А., Воронина Д.В., Попова О., Рябова Е.И., Щербинин Д.Н., Аксенова Е.И., Семенов А.Н., Кунда М.С., Рыжова Н.Н., Зубкова О.В., Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Борисевич С.В., Гинцбург А.Л. Наноантитела – потенциальный терапевтический препарат против лихорадки Эбола. Acta Naturae. 2021;13(4):53–63. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11487

25. Throsby M., van den Brink E., Jongeneelen M., Poon L.L., Alard P., Cornelissen L., Bakker A., Cox F., van Deventer E., Guan Y., Cinatl J., ter Meulen J., Lasters I., Carsetti R., Peiris M., de Kruif J., Goudsmit J. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 2008;3(12):e3942. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003942