Нокдаун клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 как супрессор вирусной активности гриппа А/WSN/33 (H1N1) в культуре клеток А549

Цели. Оценка влияния подавления экспрессии клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 на динамику репродукции вируса гриппа А в культуре легочных клеток человека А549.

Методы. Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И.И. Мечникова (Россия). Вируссодержащую жидкость отбирали в течение трех дней с момента трансфекции и заражения и оценивали интенсивность вирусной репродукции методами титрования по цитопатическому действию и в реакции гемагглютинации. Концентрацию вирусной РНК определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни.

Результаты. В клетках, обработанных малыми интерферирующими РНК (миРНК) к генам FLT4, Nup98 и Nup205, отмечалось достоверное подавление экспрессии целевых генов и показателей вирусной репродукции (титр вируса, гемагглютинирующая активность, концентрация вирусной РНК) при коэффициенте множественности заражения, равном 0.1. Дополнительно было установлено, что подавление экспрессии целевых генов с помощью миРНК не приводит к значительному снижению выживаемости клеток. Вирусный титр в клетках, обработанных миРНК FLT4.2, Nup98.1 и Nup205, на первые сутки был меньше в среднем на 1.0 lg, а на вторые и третьи – на 2.2–2.3 lg, по сравнению с клетками, обработанными неспецифической миРНК. При проведении ОТ-ПЦР-РВ отмечено достоверное уменьшение концентрации вирусной РНК с миРНК Nup98.1 (до 190 раз) и Nup205 (до 30 раз) на первые сутки, в 26 и в 29 раз на вторые и в 6 и 30 раз на третьи сутки, соответственно. Для миРНК FLT4.2 количество копий вирусной РНК уменьшилось в 23, 18 и 16 раз на первые, вторые и третьи сутки. Схожие результаты были получены при определении гемагглютинирующей активности вируса. Наиболее сильно, в 16 раз, гемагглютинирующая активность на третьи сутки снизилась в клетках, обработанных миРНК Nup205 и FLT4.2. В клетках, обработанных миРНК FLT4.1, Nup98.1 и Nup98.2, гемагглютинирующая активность уменьшилась в 8 раз.

Выводы. В ходе исследования были выявлены три клеточных гена (FLT4, Nup98 и Nup205), подавление экспрессии которых позволяет эффективно уменьшить вирусную репродукцию, а также получены оригинальные последовательности миРНК. Полученные результаты имеют важное значение для создания терапевтических и профилактических препаратов, чье действие основано на механизме РНК-интерференции.

1. Hussain M., Galvin H.D., Haw T.Y., Nutsford A.N., Husain M. Drug resistance in influenza A virus: the epidemiology and management. Infect. Drug Resist. 2017 Apr 20;10:121–134. https://doi.org/10.2147/IDR.S105473

2. Peasah S.K., Azziz-Baumgartner E., Breese J, Meltzer M.I., Widdowson MA. Influenza cost and cost-effectiveness studies globally – a review. Vaccine. 2013;31(46):5339–5348. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2013.09.013

3. Rezkalla S.H., Kloner R.A. Influenza-related viral myocarditis. WMJ. 2010;109(4):209–213. PMID: 20945722. URL: https://wmjonline.org/wp-content/uploads/2010/109/4/209.pdf

4. Nguyen J.L., Yang W., Ito K., Matte T.D., Shaman J., Kinney P.L. Seasonal Influenza Infections and Cardiovascular Disease Mortality. JAMA Cardiol. 2016;1(3):274–281. PMID: 27438105; PMCID: PMC5158013 https://doi.org/10.1001/jamacardio.2016.0433

5. Ekstrand J.J. Neurologic complications of influenza. Semin. Pediatr. Neurol. 2012;19(3):96–100. https://doi.org/10.1016/j.spen.2012.02.004

6. Edet A., Ku K., Guzman I., Dargham H.A. Acute Influenza Encephalitis/Encephalopathy Associated with Influenza A in an Incompetent Adult. Case Rep. Crit. Care. 2020;2020:6616805. https://doi.org/10.1155/2020/6616805

7. Err H., Wiwanitkit V. Emerging H6N1 influenza infection: renal problem to be studied. Ren. Fail. 2014;36(4):662. https://doi.org/10.3109/0886022X.2014.883934

8. Ленева И.А., Егоров А.Ю., Фалынскова И.Н., Махмудова Н.Р., Карташова Н.П., Глубокова Е.А., Вартанова Н.О., Поддубиков А.В. Индукция вторичной бактериальной пневмонии у мышей при заражении пандемическим и лабораторным штаммами вируса гриппа H1N1. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;(1):68–74. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-68-74

9. Metersky M.L., Masterton R.G., Lode H., File T.M. Jr., Babinchak T. Epidemiology, microbiology, and treatment considerations for bacterial pneumonia complicating influenza. Int. J. Infect. Dis. 2012;16(5):e321–31. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2012.01.003

10. Vanderbeke L., Spriet I., Breynaert C., Rijnders B.J.A., Verweij P.E., Wauters J. Invasive pulmonary aspergillosis complicating severe influenza: epidemiology, diagnosis and treatment. Curr. Opin. Infect. Dis. 2018;31(6):471–480. https://doi.org/10.1097/QCO.0000000000000504

11. Van der Vries E., Schutten M., Fraaij P., Boucher C., Osterhaus A. Influenza virus resistance to antiviral therapy. Adv. Pharmacol. 2013;67:217–246. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405880-4.00006-8

12. Han J., Perez J., Schafer A., Cheng H., Peet N., Rong L., Manicassamy B. Influenza Virus: Small Molecule Therapeutics and Mechanisms of Antiviral Resistance. Curr. Med. Chem. 2018;25(38):5115–5127. https://doi.org/10.2174/0929867324666170920165926

13. Looi Q.H., Foo J.B., Lim M.T., Le C.F., Show P.L. How far have we reached in development of effective influenza vaccine? Int. Rev. Immunol. 2018;37(5):266–276. https://doi.org/10.1080/08830185.2018.1500570

14. Pleguezuelos O., James E., Fernandez A., Lopes V., Rosas L.A., Cervantes-Medina A., Cleath J., Edwards K., Neitzey D., Gu W., Hunsberger S., Taubenberger J.K., Stoloff G., Memoli M.J. Efficacy of FLU-v, a broad-spectrum influenza vaccine, in a randomized phase IIb human influenza challenge study. NPJ Vaccines. 2020;5(1):22. https://doi.org/10.1038/s41541-020-0174-9

15. Wang F., Chen G., Zhao Y. Biomimetic nanoparticles as universal influenza vaccine. Smart Mater. Med. 2020;1:21–23. https://doi.org/10.1016/j.smaim.2020.03.001

16. Smith M. Vaccine safety: medical contraindications, myths, and risk communication. Pediatr. Rev. 2015;36(6):227–238.

17. Wang J., Wu Y., Ma C., Fiorin G., Wang J., Pinto L.H., et al. Structure and inhibition of the drug-resistant S31N mutant of the M2 ion channel of influenza A virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013;110(4):1315–1320. https://doi.org/10.1073/pnas.1216526110

18. Leneva I.A., Russell R.J., Boriskin Y.S., Hay A.J. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: Implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol. Antiviral Res. 2009;81(2):132–140. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2008.10.009

19. Hurt A.C., Ernest J., Deng Y.M., Iannello P., Besselaar T.G., Birch C., et al. Emergence and spread of oseltamivirresistant influenza A (H1N1) viruses in Oceania, Southeast Asia and South Asia. Antiviral Res. 2009;83(1):90–93. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2009.03.003

20. Hurt A.C. The epidemiology and spread of drug resistant human influenza viruses. Curr. Opin. Virol. 2014;8:22–29. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2014.04.009

21. Lampejo T. Influenza and antiviral resistance: an overview. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020;39(7):1201–1208. https://doi.org/10.1007/s10096-020-03840-9

22. Fire A.Z. Gene silencing by double-stranded RNA. Cell Death Differ. 2007;14(12):1998–2012. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4402253

23. Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mell C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;391(6669): 806–811. https://doi.org/10.1038/35888

24. Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Зверев В.В. Перспективы создания противовирусных препаратов на основе малых интерферирующих РНК. Вопросы вирусологии. 2013;(S1):155–169. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/perspektivy-sozdaniya-protivovirusnyh-preparatov-na-osnove-malyh-interferiruyuschih-rnk

25. McManus M.T., Sharp P.A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet. 2002;3(10):737–747. https://doi.org/10.1038/nrg908

26. Estrin M.A., Hussein I.T.M., Puryear W.B., Kuan A.C., Artim S.C., Runstadler J.A. Host-directed combinatorial RNAi improves inhibition of diverse strains of influenza A virus in human respiratory epithelial cells. PLoS One. 2018;13(5):e0197246. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197246

27. Janssen H.L., Reesink H.W., Lawitz E.J., Zeuzem S., Rodriguez-Torres M., Patel K., van der Meer A.J., Patick A.K., Chen A., Zhou Y., Persson R., King B.D., Kauppinen S., Levin A.A., Hodges M.R. Treatment of HCV infection by targeting microRNA. N. Engl. J. Med. 2013;368(18):1685–1394. https://doi.org/10.1056/nejmoa1209026

28. Qureshi A., Tantray V.G., Kirmani A.R., Ahangar A.G. A review on current status of antiviral siRNA. Rev. Med. Virol. 2018;28(4):e1976. https://doi.org/10.1002/rmv.1976

29. Hoy S.M. Patisiran: First Global Approval. Drugs. 2018;78(15):1625–1631. https://doi.org/10.1007/s40265-0180983-6

30. Lesch M., Luckner M., Meyer M., Weege F., Gravenstein I., Raftery M., Sieben C., Martin-Sancho L., ImaiMatsushima A., Welke R.W., Frise R., Barclay W., Schönrich G., Herrmann A., Meyer T.F, Karlas A. RNAi-based small molecule repositioning reveals clinically approved ureabased kinase inhibitors as broadly active antivirals. PLoS Pathog. 2019;15(3):e1007601. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007601

31. Karlas A., Machuy N., Shin Y., Pleissner K.P., Artarini A., Heuer D., et al. Genome-wide RNAi screen identifies human host factors crucial for influenza virus replication. Nature. 2010;463(7282):818–822. https://doi.org/10.1038/nature08760

32. Arenas-Hernandez M., Vega-Sanchez R. Housekeeping gene expression stability in reproductive tissues after mitogen stimulation. BMC Res. Notes. 2013;6:285. https://doi.org/10.1186/1756-0500-6-285

33. Lee H.K., Loh T.P., Lee C.K., Tang J.W., Chiu L., Koay E.S. A universal influenza A and B duplex real-time RTPCR assay. J. Med. Virol. 2012;84(10):1646–1651. https://doi.org/10.1002/jmv.23375

34. Ramakrishnan M.A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J. Virol. 2016;5(2):85–86. https://doi.org/10.5501/wjv.v5.i2.85

35. Eierhoff T., Hrincius E.R., Rescher U., Ludwig S., Ehrhardt C. The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) promotes uptake of influenza А viruses (IAV) into host cells. PLoS Pathog. 2010;6(9):e1001099. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1001099

36. Shaw M.L., Stertz S. Role of Host Genes in Influenza Virus Replication. In: Tripp R., Tompkins S. (Eds.). Roles of Host Gene and Non-coding RNA Expression in Virus Infection. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2017;419:151–189. https://doi.org/10.1007/82_2017_30

37. Watanabe T., Watanabe S., Kawaoka Y. Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host & Microbe. 2010;7(6):427–439. https://doi.org/10.1016/j.chom.2010.05.008

38. Hussain M., Galvin H.D., Haw T.Y., Nutsford A.N., Husain M. Drug resistance in influenza A virus: the epidemiology and management. Infect. Drug Resist. 2017;10:121–134. https://doi.org/10.2147/IDR.S105473

39. Sanjuán R., Domingo-Calap P. Mechanisms of viral mutation. Cell. Mol. Life Sci. 2016;73(23):4433–4448. https://doi.org/10.1007/s00018-016-2299-6

40. Presloid J.B., Novella I.S. RNA viruses and RNAi: quasispecies implications for viral escape. Viruses. 2015;7(6):3226–3240. https://doi.org/10.3390/v7062768

41. Das A.T., Brummelkamp T.R., Westerhout E.M., Vink M., Madiredjo M., Bernards R., et al. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interferencemediated inhibition. J. Virol. 2004;78(5):2601–5. https://doi.org/10.1128/JVI.78.5.2601-2605.2004

42. Rupp J.C., Locatelli M., Grieser A., Ramos A., Campbell P.J., Yi H., et al. Host cell copper transporters CTR1 and ATP7A are important for Influenza A virus replication. Virol J. 2017;14(1):11. https://doi.org/10.1186/s12985-0160671-7

43. Wang R., Zhu Y., Zhao J., Ren C., Li P., Chen H., et al. Autophagy Promotes Replication of Influenza A Virus In Vitro. J. Virol. 2019;93(4):e01984–18. https://doi.org/10.1128/JVI.01984-18