Особенности оптимизации мультипраймерной ПЦР для выявления возбудителей инфекционной пневмонии человека

Цели. Разработка мультипраймерной системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленной на одновременное выявление шести основных бактериальных возбудителей пневмонии человека; выявление параметров и закономерностей, имеющих важное значение для оптимизации мультипраймерной системы, в том числе для разработки систем ПЦР в иммобилизованной фазе (на биологическом микрочипе).
Методы. Для определения оптимальных параметров системы использовали методы ПЦР в т.н. «моноплексном» и мультиплексном форматах.
Результаты. Сконструированы праймеры, и оптимизирован температурно-временной профиль проведения ПЦР в объеме для выявления Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae и Streptococcus pneumoniae. Выявлены закономерности конструирования праймеров для ПЦР в иммобилизованной фазе.
Выводы. Изученные закономерности особенностей оптимизации мультипраймерных систем позволили разработать прототип системы, способной специфично выявлять шесть клинически значимых возбудителей пневмонии человека. Прототип системы может быть расширен для анализа вирусных и грибковых патогенов и применяться в клинической диагностике. Результаты изучения особенностей мультиплексной ПЦР в иммобилизованной фазе привели к созданию прототипа системы для выявления патогенных агентов на биологическом микрочипе.

1. Nair G.B., Niederman M.S. Community-acquired pneumonia: an unfinished battle. Med. Clin. North Am. 2011;95(6):1143–1161. https://doi.org/10.1016/j.mcna.2011.08.007

2. Harris M., Clark J., Coote N., Fletcher P., Harnden A., McKean M., Thomson A. British Thoracic Society Standards of Care Committee. British Thoracic Society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 2011;66:ii1–ii23(Suppl. 2). https://doi.org/10.1136/thoraxjnl-2011-200598

3. Rawson T.M., Wilson R.C., Holmes A. Understanding the role of bacterial and fungal infection in COVID-19. Clin. Microbiol. Infect. 2021;27(1):9–11. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2020.09.025

4. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., Авдеев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А., Рачина С.А., Фесенко О.В. Российское респираторное общество (РРО) Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ) Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике тяжелой внебольничной пневмонии у взрослых. Пульмонология. 2014;(4):13–48. https://doi.org/10.18093/0869-0189-2014-0-4-13-48 [Chuchalin A.G., Sinopal’nikov A.I., Kozlov R.S., Avdeev S.N., Tyurin I.E., Rudnov V.A., Rachina S.A., Fesenko O.V. Russian Respiratory Society Interregional association on clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy Clinical guidelines on diagnosis, treatment and prevention of severe community acquired pneumonia in adults. PULMONOLOGIYA. 2014;(4):13–48 (in Russ.). https://doi.org/10.18093/0869-0189-2014-0-4-13-48

5. Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний. Клинич. Микробиол. и Антимикроб. Химиотер. 2000;2(1):60–68. URL: https://cmac-journal.ru/publication/2000/1/cmac-2000-t02-n1-p060/cmac-2000-t02-n1-p060.pdf [Tartakovskii I.S. Modern approaches to the diagnosis of atypical pneumonia. Klin. Mikrobiol. Antimikrob. Khimioterap. = Clin. Microbiol. Antimicrob. Chemotherapy. 2000;2(1):60–68 (in Russ.). Available from URL: https://cmac-journal.ru/en/publication/2000/1/cmac-2000-t02-n1-p060/cmac-2000-t02-n1-p060.pdf]

6. Бруснигина Н.Ф., Мазепа В.Н., Самохина Л.П. и др. Этиологическая структура внебольничной пневмонии. Мед. Альманах. 2009;2(7):118–121. [Brusnigina N.F., Mazepa V.N., Samokhina L.P., et al. Etiological structure of community-acquired pneumonia. Med. Al’manakh = Med. Alm. 2009;2(7):118–121 (in Russ.).]

7. Doyle J.J., Doyle J.L. A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochemical Bullettin. 1987;19(1):11–15.

8. Morona J.K., Morona R., Miller D.C., Paton J.C. Streptococcus pneumoniae capsule biosynthesis protein CpsB is a novel manganese-dependent phosphotyrosine-protein phosphatase. J. Bacteriol. 2002;184(2):577–583. https://doi.org/10.1128/JB.184.2.577-583.2002

9. Liu Y., Cao Y., Wang T., Dong Q., Li J., Niu C. Detection of 12 Common Food-Borne Bacterial Pathogens by TaqMan Real-Time PCR Using a Single Set of Reaction Conditions. Front Microbiol. 2019;10:222. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00222

10. Xirogianni A., Tzanakaki G., Karagianni E., Markoulatos P., Kourea-Kremastinou J. Development of a single-tube polymerase chain reaction assay for the simultaneous detection of Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Streptococcus spp. directly in clinical samples. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2009;63(2):121–126. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2008.09.017

11. Huletsky A., Giroux R., Rossbach V., Gagnon M., Vaillancourt M., Bernier M., Gagnon F., Truchon K., Bastien M., Picard F.J, van Belkum A., Ouellette M., Roy P.H., Bergeron M.G. New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci. J. Clin. Microbiol. 2004;42(5):1875–1884. https://doi.org/10.1128/JCM.42.5.1875-1884.2004

12. Morrison K.E., Lake D., Crook J., Carlone G.M., Ades E., Facklam R., Sampson J.S. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. J. Clin. Microbiol. 2000;38(1):434–437. https://doi.org/10.1128/jcm.38.1.434-437.2000

13. Binks M.J., Temple B., Kirkham L.-A., Wiertsema S.P., Dunne E.M., et al. Molecular Surveillance of True Nontypeable Haemophilus influenzae: An Evaluation of PCR Screening Assays. PLoS ONE. 2012;7(3):e34083. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0034083

14. De Vos D., Lim A.Jr., Pirnay J.P., et al. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes, oprI and oprL. J. Clin. Microbiol. 1997;35(6):1295–1299. https://doi.org/10.1128/jcm.35.6.1295-1299.1997

15. Tabatabaei M., Hemati Z., Moezzi M.O., Azimzadeh N. Isolation and identification of Legionella spp. from different aquatic sources in south-west of Iran by molecular &culture methods. Mol. Biol. Res. Commun. 2016;5(4):215–223. https://dx.doi.org/10.22099/mbrc.2016.3858

16. Turton J.F., Perry C., Elgohari S., Hampton C.V. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific, variable number tandem repeat and virulence gene targets. J. Med. Microbiol. 2010;59(5):541–547. https://doi.org/10.1099/jmm.0.015198-0