ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА ЭПО-Fc МЕТОДАМИ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ФОКУСИРОВАНЕИМ (IEF-PAGE) И В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА (SDS-PAGE)/ЛАУРИЛСАРКОЗИНАТА НАТРИЯ (SAR-PAGE) С ЦЕЛЬЮ АНТИДОПИНГОВОГО КОНТРОЛЯ

Статья посвящена разработке подхода по идентификации нового стимулятора кроветворения, гибридного белка ЭПО-Fc, запрещенного Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА) для употребления спортсменами и являющегося допингом. Существующие в рутинной практике антидопинговых лабораторий мира методы качественного определения данного вещества с помощью полиакриламидного гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата (SDS-PAGE) и лаурилсаркозината (SAR-PAGE) натрия недостаточно специфичны. В статье описана принципиальная возможность идентификации ЭПО-Fc методом изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле (IEF-PAGE) с градиентом рН 2-6 после удаления Fc-части молекулы посредством ферментативного гидролиза. Показано, что удаление кристаллизуемого фрагмента приводит к уменьшению молекулярной массы всей гибридной молекулы и увеличению ее электрофоретической подвижности, что позволяет специфично детектировать запрещенное вещество существующими методами. В ходе исследования выбран фермент для гидролитического расщепления ЭПО-Fc и подобраны оптимальные условия гидролиза в образцах сыворотки крови.

гибридный белок ЭПО-Fc, ферментативный гидролиз, электрофорез, фрагмент ЭПО-шарнир, антидопинговый контроль

1. Bitonti A.J., Dumont J.A., Low S.C., Peters R.T., Kropp K.E., Palombella V. J., Stattel J. M., Lu Y., Tan C.A., Song J.J., Garcia A.M., Simister N.E., Spiekermann G.M., Lencer W.I., Blumberg R.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. Is. 26. P. 9763-9768.

2. Патент 7250493 США, В2 / патентообладатель L.H.K. Sun, B.N.C. Sun, C.R.Y. Sun; заявл. 17.12.2004; опубл. 31.07.2007.

3. Патент 20050202538 США, A1 / S. Gillies, J. Way, K.M. Lo; патентообладатель Merck Patent GmbH; заявл. 30.12.2004; опубл. 15.09. 2005.

4. Патент 8431132 США, B2 / H. Wang, D.U. Yong, R. Zhang, J. Hu, L. Liu; патентообладатель Novagen Holding Corporation; опубл. 30.04.2013.

5. Запрещенный список ВАДА 2016 года [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.rusada.ru/sites/default/files/content/files/Запрещенный%20список%202016%20года(1).pdf. (дата обращения 16.08.2016).

6. Postnikov P.V., Krotov G.I., Efimova Yu.A., Rodchenkov G.M. // Russ. Chem. Rev. 2016. V. 85. № 2. P. 99-114. DOI: 10.1070/RCR4563.

7. Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. Is. 1. P. 43-50.

8. Reichel C.,Abzieher F., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. P. 494-504.

9. Технический документ ВАДА [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-TD2014EPO-v1-Harmonization-of-Analysis-and-Reporting-of-ESAs-by-Electrophoretic-Techniques-EN.pdf (Дата обращения 11.06.2016).

10. Reichel C., Thevis M. // Drug Test. Anal. 2012. V. 4. Is. 11. P. 818-829.

11. Postnikov P., Krotov G., Mesonzhnik N., Efimova Y., Rodchenkov G. // Drug Test. Anal. 2015. V. 7. № 11-12. P. 999-1008.

12. Reichel C. // Drug Test. Anal. 2014. V. 2. P. 603-619.

13. Promega Corporation. IdeS protease protocol. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://worldwide.promega.com/~/media/files/resources/protocols/product%20information%20sheets/n/ides%20protease%20protocol.pdf (дата обращения 18.05.2016)

14. Reichel C., Abzieher F., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. P. 494-504.

15. Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. № 1. P. 43-50.

16. Dunn M.J. Electrophoresis / Editor M.J. Dunn. Wiley-VCH, Weinheim, 1986. P. 687.

17. Lasne F. // J. Immunol. Methods. 2003. V. 276. № 1-2. P. 223-226.

18. MAIIA Diagnostics EPO Purification kit. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://maiiadiagnostics.com/products/epo_purification_kit/(дата обращения 15.02.2016)

19. Lönnberg M., Dehnes Y., Drevin M., Garle M., Lamon S., Leuenberger N., Quach T., Carlsson J. // J. Chromatogr. A. 2010. V. 1217. № 45. P. 7031-7037.

20. Collin M., Olsen A. // EMBO J. 2001. V. 20. № 12 P. 3046-3055.

21. Collin M., Olsen A. // Infect. Immun. 2001. V. 69. № 11. P. 7187-7189.

22. Zhang Z., Perrault R., Zhao Y., Ping J. // J. Chromatogr. B. 2016. V. 1020. P. 148-157.

23. Wang A. C., Wang I. Y. // Immunochemistry. 1976. V. 14. P. 197-200.

24. An Y., Zhang Y., Mueller H.-M., Shameem M., Chen X. // MAbs. 2014. V. 6. № 4. P. 879-893.

25. von Pawel-Rammingen U., Johansson B.P., Björck L. // EMBO J. 2002. V. 21. № 7. P. 1607-1615.

26. Chevreux G., Tilly N., Bihoreau N. // Anal. Biochem. 2011. V. 415. P. 212-214.

27. Wenig K., Chatwell L., von Pawel-Rammingen U., Björck L., Huber R., Sondermann P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 17371-17376.

28. Wagner-Rousset E., Janin-Bussat M.-C., Colas O., Excoffier M., Ayoub D., Haeuw J.-F., Rilatt I., Perez M. // MAbs. 2014. V. 6. P. 1-12.

29. Elliott S.D. // J. Exp. Med. 1945. V.81. № 6. P. 573-592.

30. Burton D.R. // Mol. Immunol. 1985. V. 22. P. 161-206.

31. Adamczyk M., Gebler J.C., Wu J. // J. Immunol. Methods. 2000. V. 237. P. 95-104.

32. Jefferis R. // Expert Opin. Biol. Ther. 2007. V. 7. № 9. P. 1401-1413.

33. Goetze A.M., Zhang Z., Liu L., Jacobsen F.W., Flynn G.C. // Mol. Immunol. 2011. V. 49. P. 338-352.

34. Goetze A.M., Liu L., Arroll T., Chu L., Flynn G.C. // Glycobiology. 2012. V. 22. P. 221-234.

35. Strand J., Huang C.-T., Xu J. // J. Pharm. Sci. 2013. V. 102. P. 441-453.

36. Lynaugh H., Li H., Gong B. // MAbs. 2013. V. 5. P. 641-645.

37. Bajla I., Holländer I., Minichmayer M., Gmeiner G., Reichel C. // Comput. Meth. Programs Biomed. 2005. V. 80. P. 246-270.