Разработка и масштабирование технологии хроматографической очистки однодоменных антител, слитых с Fc-фрагментом IgG1 человека

Цели. Разработать технологию хроматографической очистки для препаратов на основе модифицированных однодоменных антител, специфичных к вирусу SARS-CoV-2. Подобрать оптимальные параметры процесса очистки и масштабировать данную технологию на производстве.

Методы. Исследование проводилось на культуре клеток яичников китайского хомячка CHO GAMP2C5  клон 78, СНО B5 клон 4, СНО B10 клон 4, продуцирующих модифицированные однодоменные антитела GAMP2C5, GAMB5, GAMB10 соответственно. Хроматографическая очистка проводилась с применением хроматографов AKTA Pure 25 и AKTA Pilot 600s. Контроль качества полученных препаратов был осуществлен при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, капиллярного гель-электрофореза, динамического рассеяния света, иммуноферментного анализа, полимеразной цепной реакции.

Результаты. Мультимодальная хроматография с применением сорбента Ca⁺⁺Pure-HA (TOSOH, Япония) на основе керамического гидроксиапатита 1 типа позволяет эффективно избавляться от агрегированных форм антитела. Препараты, полученные после хроматографии с применением сорбента Ca⁺⁺Pure-HA на основе керамического гидроксиапатита 1, имеют чистоту более 97%. Разработанная технология очистки была масштабирована до очистки объемом 200 л культуральной жидкости после культивирования в биореакторе STR 200.

Выводы. Разработана технология очистки модифицированных однодоменных антител с применением мультимодального сорбента Ca⁺⁺Pure-HA на основе керамического гидроксиапатита 1 типа, позволяющая эффективно избавляться от низкомолекулярных примесей и агрегированных форм антитела. Полученные с помощью разработанной технологии антитела характеризуются высокой степенью чистоты, отсутствием различных примесей (остаточного белка штамма продуцента, остаточного белка А и остаточного ДНК штамма продуцента), а также обладают гидродинамическим радиусом молекул, соответствующим теоретическому значению мономерной форм антител.

1. Mekala J.R., Nalluri H.P., Reddy P.N., Sainath S.B., Sampath Kumar N.S., Sai Kiran G.V.S.D., Dhiman R., Chamarthy S., Komaragiri R.R., Manyam R.R., Dirisala V.R. Emerging trends and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Gene. 2024;20(925):148607. https://doi.org/10.1016/j.gene.2024.148607

2. Esposito S., Amirthalingam G., Bassetti M., Blasi F., De Rosa F.G., Halasa N.B., Principi N. Monoclonal antibodies for prophylaxis and therapy of respiratory syncytial virus, SARS-CoV-2, human immunodeficiency virus, rabies and bacterial infections: An update from the world association of infectious diseases and immunological disorders and the Italian society of antinfective therapy. Front. Immunol. 2023;14:1162342. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1162342

3. Wang Z., Wang G., Lu H., Li H., Tang M., Tong A. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Mol. Biomed. 2022;3:35. https://doi.org/10.1186/S43556-022-00100-4

4. Paul S., Konig M.F., Pardoll D.M., Bettegowda C., Papadopoulos N., Wright K.M., Gabelli S.B., Ho M., van Elsas A., Zhou S. Cancer therapy with antibodies. Nature Reviews Cancer. 2024;24(6):399–426. https://doi.org/10.1038/s41568-024-00690-x

5. Kumar M., Jalota A., Sahu S.K., Haque S. Therapeutic antibodies for the prevention and treatment of cancer. J. Biomed. Sci. 2024;31(1):6. https://doi.org/10.1186/s12929-024-00996-w

6. Kügler M., Stein C., Schwenkert M., Saul D., Vockentanz L., Huber T., et al. Stabilization and humanization of a singlechain Fv antibody fragment specific for human lymphocyte antigen CD19 by designed point mutations and CDR-grafting onto a human framework. Protein Eng. Des. Sel. 2009;22(3): 135–147. https://doi.org/10.1093/protein/gzn079

7. Jin B.K., Odongo S., Radwanska M., Magez S. Nanobodies: A review of generation, diagnostics and therapeutics. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(6):5994. https://doi.org/10.3390/IJMS24065994

8. Klein C., Brinkmann U., Reichert J.M., Kontermann R.E. The present and future of bispecific antibodies for cancer therapy. Nat. Rev. Drug Discov. 2024;23(4):301–319. https://doi.org/10.1038/s41573-024-00896-6

9. Wang M., Ying T., Wu Y. Single-domain antibodies as therapeutics for solid tumor treatment. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2024;14(7):2854–2868. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2024.03.016

10. Cheng L., Chen L., Shi Y., Gu W., Ding W., Zheng X., Liu Y., Jiang J., Zheng Z. Efficacy and safety of bispecific antibodies vs. immune checkpoint blockade combination therapy in cancer: A real-world comparison. Mol. Cancer. 2024;23(1):77. https://doi.org/10.1186/s12943-024-01956-6

11. Zacharias N., Podust V.N., Kajihara K.K., Leipold D., Del Rosario G., Thayer D., Dong E., Paluch M., Fischer D., Zheng K., Lei C. A homogeneous high-DAR antibody–drug conjugate platform combining THIOMAB antibodies and XTEN polypeptides. Chem. Sci. 2022;13(11):3147–3160. https://doi.org/10.1039/D1SC05243H

12. Полянский Д.С., Рябова Е.И., Деркаев А.А., Старков Н.С., Кашапова И.С., Щебляков Д.В., Карпов А.П., Есмагамбетов И.Б. Разработка технологии культивирования клеточной линии, продуцирующей однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом IgG1 человека. Тонкие химические технологии. 2024;19(3): 240–257. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2024-19-3-240-257

13. Kelley B. Industrialization of mAb production technology: The bioprocessing industry at a crossroads. MAbs. 2009;1(5): 443–452. https://doi.org/10.4161/mabs.1.5.9448

14. Ulmer N., Vogg S., Müller-Späth T., Morbidelli M. Purification of Human Monoclonal Antibodies and Their Fragments. In: Steinitz M. (Ed.). Human Monoclonal Antibodies. Methods in Molecular Biology. 2019. V. 1904. P. 163–188. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8958-4_7

15. Есмагамбетов И.Б., Щебляков Д.В., Егорова Д.А., Воронина О.Л., Деркаев А.А., Воронина Д.В., Попова О., Рябова Е.И., Щербинин Д.Н., Аксенова Е.И., Семенов А.Н., Кунда М.С., Рыжова Н.Н., Зубкова О.В., Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Борисевич С.В., Гинцбург А.Л. Наноантитела – потенциальный терапевтический препарат против лихорадки Эбола. Acta Naturae. 2021;13(4):53–63. https://doi.org/10.32607/actanaturae.11487

16. Derkaev A.A., Ryabova E.I., Esmagambetov I.B., Shcheblyakov D.V., Godakova S.A., Vinogradova I.D., Noskov A.N., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. rAAV expressing recombinant neutralizing antibody for the botulinum neurotoxin type a prophylaxis. Front. Microbiol. 2022;13:960937. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.960937

17. Voronina D.V., Shcheblyakov D.V., Favorskaya I.A., Esmagambetov I.B., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Popova O., Kan V.Y., Bandelyuk A.S., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditskiy B.S., Gintsburg A.L. Cross-Reactive Fc-Fused Single-Domain Antibodies to Hemagglutinin Stem Region Protect Mice from Group 1 Influenza a Virus Infection. Viruses. 2022;14(11):2485. https://doi.org/10.3390/v14112485

18. Panova E.A., Kleymenov D.A., Shcheblyakov D.V., Bykonia E.N., Mazunina E.P., Dzharullaeva A.S., Zolotar A.N., Derkaev A.A., Esmagambetov I.B., Sorokin I.I., Usachev E.V., Noskov A.N., Ivanov I.A., Zatsepin T.S., Dmitriev S.E., Gushchin V.A., Naroditsky B.S., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. Single-domain antibody delivery using an mRNA platform protects against lethal doses of botulinum neurotoxin A. Front. Immunol. 2023;14:1098302. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1098302

19. Godakova S.A., Noskov A.N., Vinogradova I.D., Ugriumova G.A., Solovyev A.I., Esmagambetov I.B., Tukhvatulin AI., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Shcheblyakov D.V., Gintsburg A.L. Camelid VHHs Fused to Human Fc Fragments Provide Long Term Protection Against Botulinum Neurotoxin A in Mice. Toxins (Basel). 2019;11(8):464. https://doi.org/10.3390/toxins11080464

20. Esmagambetov I.B., Ryabova E.I., Derkaev A.A., Shcheblyakov D.V., Dolzhikova I.V., Favorskaya I.A.,

21. Grousova D.M., Dovgiy M.A., Prokofiev V.V., Gosudarev A.I., Byrikhina D.V., Zorkov I.D., Iliukhina A.A., Kovyrshina A.V., Shelkov A.Y., Naroditsky B.S., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. rAAV expressing recombinant antibody for emergency prevention and long-term prophylaxis of COVID-19. Front. Immunol. 2023;14:1129245. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1129245

22. Favorskaya I.A., Shcheblyakov D.V., Esmagambetov I.B., Dolzhikova I.V., Alekseeva I.A., Korobkova A.I., Voronina D.V., Ryabova E.I., Derkaev A.A., Kovyrshina A.V., et al. Single-Domain Antibodies Efficiently Neutralize SARS-CoV-2 Variants of Concern. Front. Immunol. 2022;13:822159. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.822159

23. Shcheblyakov D.V., Favorskaya I.A., Dolzhikova I.V., Korobkova A.I., Esmagambetov I.V., Voronina O.L., Zubkova O.V., Tukhvatulin A.I., Derkaev A.A., Ryabova E.I., Iliukhina A.A., Zorkov I.D., Grousova D.M., Reshetnikov D.A., Ryzhova N.N., Ermolova E.I., Kunda M.S., Matyuta I.O., Boyko K.M., Gintsburg A.L. Ultra-potent RBM-specific singledomain antibody broadly neutralizes multiple SARS-CoV-2 variants with picomolar activity. Int. J. Biol. Macromol. 2025; 19(Pt 3):145386. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.145386

24. Седова Е.С., Щербинин Д.Н., Банделюк А.С., Верховская Л.В., Вискова Н.Ю., Авдонина Е.Д., Прокофьев В.В., Рябова Е.И., Есмагамбетов И.Б., Первойкина К.А., Богачева Е.А., Лысенко А.А., Шмаров М.М. Способ получения рекомбинантных антител, продуцируемых клеточной линией, трансдуцированной рекомбинантными аденовирусами. Тонкие химические технологии. 2023;18(1):48–64. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2023-18-1-48-64

25. Деркаев А.А., Рябова Е.И., Есмагамбетов И.Б., Щебляков Д.В., Носков А.Н., Виноградова И.Д., Прокофьев В.В., Полянский Д.С.., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л. Кандидатный препарат на основе модифицированных однодоменных антител для терапии ботулизма, вызванного ботулиническим токсином типа А. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2025;25(1):58–70. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2025-591