Исследование субстратных свойств флуоресцентно-меченых пиримидинтрифосфатов в рекомбиназной полимеразной амплификации

Цели. Изучить субстратные свойства трифосфатов дезоксинуклеозидов различной природы (dU и dC), флуоресцентно-меченых красителями цианинового ряда Cy5, при их встраивании в цепь ДНК в процессе рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA).
Методы. В работе использовали метод RPA в режиме реального времени. Для контроля качества получаемых продуктов амплификации использовали метод горизонтального электрофореза.
Результаты. Исследовано влияние строения флуорофора и длин линкеров между красителем и азотистым основанием нуклеотида, а также вторым гетероциклом флуорофора и четвертичной аммониевой группой, на субстратные свойства для дезоксинуклеозидтрифосфатов Cy5-dUTP и Cy5-dCTP. Определены значения параметров субстратной эффективности: эффективности амплификации (кинетического показателя), а также нормированного выхода продукта и коэффициента встраивания.
Выводы. Модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) с длинными линкерами между флуорофором и азотистым основанием нуклеотида, а также между четвертичной аммониевой группой и вторым гетероциклом флуорофора, показывали большую субстратную эффективность, в отличие от флуоресцентно-меченых dNTP с короткими линкерами. Модифицированные dU в каждой паре демонстрировали большую субстратную эффективность по сравнению с модифицированными dC.

1. Boháčová S., Ludvíková L., Poštová Slavětínská L., Vaníková Z., Klán P., Hocek M. Protected 5-(hydroxymethyl)uracil nucleotides bearing visible-light photocleavable groups as building blocks for polymerase synthesis of photocaged DNA. Org. Biomol. Chem. 2018;16(9):1527–1535. https://doi.org/10.1039/c8ob00160j

2. Dziuba D., Pohl R., Hocek M. Bodipy-labeled nucleoside triphosphates for polymerase synthesis of fluorescent DNA. Bioconjug. Chem. 2014;25(11):1984–1995. https://doi.org/10.1021/bc5003554

3. Wynne S.A., Pinheiro V.B., Holliger P., Leslie A.G.W. Structures of an Apo and a Binary Complex of an Evolved Archeal B Family DNA Polymerase Capable of Synthesising Highly Cy-Dye Labelled DNA. PLoS ONE. 2013;8(8):e70892. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070892

4. Ramsay N., Jemth A.S., Brown A., Crampton N., Dear P., Holliger P. CyDNA: Synthesis and Replication of Highly Cy-Dye Substituted DNA by an Evolved Polymerase. J. Am. Chem. Soc. 2010;132(14):5096–5104. https://doi.org/10.1021/ja909180c

5. Shershov V.E., Lapa S.A., Kuznetsova V.E., Spitsyn M.A., Guseinov T.O., Polyakov S.A., Stomahin A.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. Comparative Study of Novel Fluorescent Cyanine Nucleotides: Hybridization Analysis of Labeled PCR Products Using a Biochip. J. Fluoresc. 2017;27(6):2001–2016. https://doi.org/10.1007/s10895-017-2139-6

6. Bertocchi F., Delledonne A., Vargas-Nadal G., Terenziani F., Painelli A., Sissa C. Aggregates of Cyanine Dyes: When Molecular Vibrations and Electrostatic Screening Make the Difference. J. Phys. Chem. C. 2023;127(21):10185–10196. https://doi.org/10.1021/acs.jpcc.3c01253

7. Шершов В.Е., Лапа С.А., Левашова С.А., Шишкин И.Ю., Штылев Г.Ф., Шекалова Е.Ю., Василисков В.А., Заседателев А.С., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В. Синтез флуоресцентно-меченых нуклеотидов для маркирования продуктов изотермической амплификации. Биоорганическая химия. 2023;49(6):649–656. https://doi.org/10.31857/S0132342323050056

8. Telser J., Cruickshank K.A., Morrison L.E., Netzel T.L. Synthesis and characterization of DNA oligomers and duplexes containing covalently attached molecular labels: comparison of biotin, fluorescein, and pyrene labels by thermodynamic and optical spectroscopic measurements. J. Am. Chem. Soc. 1989;111(18):6966–6976. https://doi.org/10.1021/ja00200a011

9. Ren X., El-Sagheer A.H., Brown T. Efficient enzymatic synthesis and dual-colour fluorescent labelling of DNA probes using long chain azido-dUTP and BCN dyes. Nucleic Acids Res. 2016;44(8):e79. https://doi.org/10.1093/nar/gkw028

10. Лапа С.А., Волкова О.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Эффективность амплификации и субстратные свойства флуоресцентно-меченных трифосфатов дезоксиуридина в ПЦР с ДНК-полимеразами, не обладающими 3’-5’-экзонуклеазной. Биоорганическая химия. 2019;45(4):392–402. https://doi.org/10.1134/S0132342319040043

11. Piepenburg O., Williams C.H., Stemple D.L., Armes N.A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006;4(7):e204. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040204

12. Бондарева О.С., Батурин А.А., Миронова А.В. Рекомбиназная полимеразная амплификация: характеристика метода и применение в диагностике инфекционных заболеваний. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2024;101(2):270–280. https://doi.org/10.36233/0372-9311-470

13. Lobato I.M., O’Sullivan C.K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends Analyt. Chem. 2018;98:19–35. https://doi.org/10.1016/j.trac.2017.10.015

14. Лапа С.А., Мифтахов Р.А., Клочихина Е.С., Аммур Ю.И., Благодатских С.А., Шершов В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Разработка мультиплексной ОТ-ПЦР с иммобилизованными праймерами для идентифика- ции возбудителей инфекционной пневмонии человека. Молекулярная биология. 2021;55(6):944–955. https://doi.org/10.31857/S0026898421050062

15. Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. Assumption – free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett. 2003;339(1):62–66. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(02)01423-4