One-pot определение аминокислот в лекарственных препаратах методом предколоночной дериватизации с фенилизотиоцианатом

Цели. Разработать новую методику определения аминокислот в лекарственных препаратах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с предколоночной дериватизацией фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) с применением one-pot пробоподготовки.

Методы. Исходные стандартные растворы аминокислот готовили методом навесок с последующим растворением в воде, после чего готовили рабочие растворы: стандартный, испытуемый и холостой, путем разведения в 20 мМ соляной кислоте. Дальнейшая пробоподготовка осуществлялась в полипропиленовых пробирках Safe-lock (Eppendorf) в реакционном буфере, содержащем подвижную фазу А, ацетонитрил и триэтиламин в соотношении 85 : 10 : 5 с окрашиванием 5% раствором ФИТЦ в ацетонитриле. После тщательного перемешивания в течение 3–5 мин на вортексе пробирки выдерживали в твердотельном термостате с термоизоляционной крышкой в течение 2 ч. Далее пробы охлаждали в течение 10 мин, центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в виалы и проводили разделение смеси аминокислот методом ОФ ВЭЖХ с использованием в качестве неподвижной фазы гидрофобного силикагеля с привитыми группами С18. Количественное определение дериватов аминокислот проводили с применением диодно-матричного детектора.

Результаты. Разработана и валидирована новая методика разделения и определения аминокислот в лекарственных препаратах, позволяющая на основе простой one-pot пробоподготовки с использованием доступных реактивов и оборудования проводить исследования без использования коммерческих наборов, например AccQ×Tag Ultra Derivatization Kit, США. На примере анализа смесей гистидина и глицина показано, что при использовании двух подвижных фаз удается достичь приемлемого разделения дериватов аминокислот в градиентном режиме в течение 20 мин со скоростью потока 1.0 мл/мин. Приготовленные по новой методике пробы продемонстрировали высокую стабильность в применении и хранении. Предложен состав подвижных фаз А и Б, состоящий из 10 мМ ацетатного буфера с рН 3.5 и 80% раствора ацетонитрила. Валидация разработанной методики при анализе лекарственного препарата Иннонафактор®, содержащего в качестве вспомогательных веществ глицин и гистидин, продемонстрировала высокую сходимость результатов количественного определения данных аминокислот.

Выводы. Новая методика определения аминокислот в лекарственных препаратах методом ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ФИТЦ обладает широким диапазоном применения, имеет ряд преимуществ по сравнению с импортными коммерческими наборами для определения аминокислот: низкую стоимость реактивов и материалов, высокую точность и повторяемость, в связи с чем она может быть рекомендована к использованию в лабораториях контроля качества фармацевтических предприятий.

1. Сломинский П.А., Шадрина М.И. Пептидные лекарственные средства: возможности, перспективы и ограничения. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018;36(1):8–14. https://doi.org/10.18821/0208-0613-2018-36-1-8-14

2. Wahl O., Holzgrabe U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 2016;154:150–163. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2016.03.071

3. Nwachukwu I.D., Aluko R.E. A systematic evaluation of various methods for quantifying food protein hydrolysate peptides. Food Chem. 2019;270:25–31. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.07.054

4. Lamp A., Kaltschmitt M., Lüdtke O. Improved HPLC-method for estimation and correction of amino acid losses during hydrolysis of unknown samples. Anal. Biochem. 2018;543;140–145. https://doi.org/10.1016/j.ab.2017.12.009

5. Полунин К.Е., Федоткина О.С., Полунина И.А., Буряк А.К. Моделирование хроматографического поведения антибактериальных пептидов в условиях ОФ ВЭЖХ. Журн. физ. химии. 2022;96(6):895–903.

6. Кочетова Л.Б., Кустова Т.П., Курицын Л.В. Реакционная способность α-аминокислот при взаимодействии со сложными эфирами в системе вода – 1,4-диоксан. Журн. общей химии. 2018;88(1):84–89.

7. Кустова Т.П., Кочетова Л.Б. Кинетика и механизм сульфонилирования α-аминокислот и дипептидов. Известия Академии наук. Серия химическая. 2019;4:809–816.

8. Кустова Т.П., Кочетова Л.Б., Хачатрян Д.С. Сравнительная реакционная способность в ацилировании дипептидов на основе тирозина и пролина. Журн. орг. химии. 2022;58(4):422–429.

9. Захарова А.М., Гринштейн И.Л., Карцова Л.А. Определение аминокислот в сухом экстракте мозга коров, пробах мяса телят и кур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сорбционные и хроматографические процессы. 2012;12(6):845–853.

10. Тарасова И.С. Иннонафактор – первый отечественный рекомбинантный фактор свертывания крови IX. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2015;14(5):70–75. https://doi.org/10.24287/1726-1708-2015-14-3-70-75

11. Тутельян В.А., Эллер К.И. (ред.). Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи. М.: Династия; 2010. 180 с. ISBN 978-5-98125-073-6