Изучение множественного встраивания модифицированных нуклеотидов в растущую цепь ДНК

Цели. Целью данной работы является изучение субстратных свойств модифицированных производных трифосфатов дезоксинуклеозидов пуриновой и пиримидиновой природы (5-пропинил-2’-дезоксиуридин-5’-трифосфат, 5-пропинил-2’-дезоксицитидин-5’-трифосфат, 5-метил-2’-дезоксицитидин-5’-трифосфат, N6-метил-2’-дезоксиаденозин-5’-трифосфат) при их одновременном встраивании в процессе ферментативных реакций (полимеразной цепной реакции и реакции удлинения праймера).

Методы. В работе для изучения субстратной эффективности модифицированных трифосфатов дезоксинуклеозидов использовали методы полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и реакции удлинения праймера. Использовали различные попарные сочетания модифицированных производных, в качестве матриц применяли специальным образом сконструированные синтетические фрагменты ДНК и библиотеки для SELEX. Реакции проводили с применением ДНК-полимераз: Taq, Vent (exo-), DeepVent (exo-) и KOD XL.

Результаты. В каждом случае из исследуемых соединений выбирали пару соединений (модифицированные dUTP + dCTP, dUTP + dATP, dCTP + dATP) для изучения одновременного встраивания в растущую цепь ДНК. Найдены наиболее эффективные сочетания нуклеотидов для одновременного встраивания, а именно: dU и dC, имеющие 5-пропинильный заместитель. Также найдена наиболее эффективная (из протестированных) ДНК-полимераза: Vent (exo-).

Выводы. Выбранные соединения можно использовать для ферментативного получения модифицированных ДНК, в частности аптамеров с расширенными физико-химическими свойствами. 

1. Lee K., Rafi M., Wang X., Aran K., Feng X., Lo Sterzo C., et al. In vivo delivery of transcription factors with multifunctional oligonucleotides. Nat. Mater. 2015;14(7):701–706. https://doi.org/10.1038/nmat4269

2. Smith C.I.E., Zain R. Therapeutic oligonucleotides: state of the art. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2019;59:605–630. https://doi.org/10.1146/annurev-pharmtox-010818-021050

3. Wandtke T., Wozniak J., Kopinski P. Aptamers in diagnostics and treatments of viral infections. Viruses. 2015;7(2):751–780. https://doi.org/10.3390/v7020751

4. Peinetti A.S., Cerertti H., Mizrahi M., Gonzales G.A., Ramires S.A., Requejo F., et al. Confined gold nanoparticles enhance the detection of small molecules in label free impedance aptasensors. Nanoscale. 2015;7:7763–7769. https://doi.org/10.1039/C5NR01429H

5. Faltin B., Zengerle R., von Stetten F. Current methods for fluorescence-based universal sequence-dependent detection of nucleic acids in homogenous assays and clinical applications. Clin.Chem. 2013;59 (11):1567–1582. https://doi.org/10.1373/clinchem.2013.205211

6. Maier K.E., Levy M. From selection hits to clinical leads progress in aptamer discovery. Mol. Ther. Methods & Clin. Develop. 2016;5:16014. https://doi.org/10.1038/mtm.2016.14

7. Hocek M. Synthesis of base-modified 2′-deoxyribonucleoside triphosphates and their use in enzymatic synthesis of modified DNA for applications in bioanalysis and chemical biology. J. Org. Chem. 2014;79(21):9914–992. https://doi.org/10.1021/jo5020799

8. Kutyavin I.V. Use of base-modified duplex-stabilizing deoxynucleoside 5’-triphosphates to enhance the hybridization properties of primers and probes in polymerase chain reaction. Biochemistry. 2008;47(51):13666–13673. https://doi.org/10.1021/bi8017784

9. Rohloff J.C., Gelinas A.D., Jarvis T.C., Ochsner U.A., Schneider D.J., Gold L., Janjic N. Nucleic Acid Ligands with Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diaognostic and Therapeutic Agents. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2014;3(10):e201. https://doi.org/10.1038/mtna.2014.49

10. Tolle F., Mayer G. Dressed for success – applying chemistry to modulate aptamer functionality. Chem. Sci. 2013;4(1):60–67. https://doi.org/10.1039/c2sc21510a

11. Gawande B.N., Rohloff J.C., Carter J.D., von Carlowitz I., Zhang C., Schneider D.J., Janjic N. Selection of DNA aptamers with two modified bases. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017;114(11):2898–2903. https://doi.org/10.1073/pnas.1615475114

12. Чудинов А.В., Шершов В.Е., Павлов А.С., Волкова О.С., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Лапа С.А. Одновременное встраивание модифицированных производных dU и dC в растущую цепь ДНК в реакции удлинения праймера и ПЦР. Биоорг. химия. 2020;46(5):546–549. https://doi.org/10.31857/S0132342320050061

13. Лапа С.А., Ромашова К.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателева О.А., Радько С.П., Тимофеев Э.Н., Лисица А.В., Чудинов А.В. Получение модифицированных комбинаторных ДНК-библиотек методом ПЦР в обратной эмульсии с последующим разделением цепей. Молекулярная биология. 2018;52(6):984–996. https://doi.org/10.1134/S0026898418060113

14. Berman A.J., Kamtekar S., Goodman J.L., Lázaro de Vega M., Blanco L., Salas M., Steitz T.A. Structures of phi29 DNA polymerase complexed with subsreate: the mechanism of translocation in B-family polymerases. EMBO J. 2007;26(14):3494–3505. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601780

15. Betz K., Malyshev D.A., Lavergne T., Welte W., Diederichs K., Dwyer T.J., Ordoukhanian P., Romesberg F.E., Marx A. KlenTaq polymerase replicates unnatural base pairs by inducing a Watson-Crick geometry. Nat. Chem. Biol. 2012;8(7):612–614. https://doi.org/10.1038/nchembio.966

16. Hollenstein M. Nucleoside triphosphates – building blocks for the modification of nucleic acids. Molecules. 2012;17(11):13569–13591. https://doi.org/10.3390/molecules171113569

17. Лапа С.А., Шершов В.Е., Краснов Г.С., Волкова О.С., Кузнецова В.Е., Радько С.П., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Метод термической диссоциации для проведения селекции ДНК-аптамеров. Биоорг. химия. 2020;46(4):411–417. https://doi.org/10.31857/S0132342320040156

18. Gold L., Ayers D., Bertino J., Bock C., Bock A., Brody E.N., Carter J., Dalby A.B., Eaton B.E., Fitzwater T., Flather D., Forbes A., Foreman T., Fowler C., Gawande B., Goss M., Gunn M., Gupta S., Halladay D., Heil J., Heilig J., Hicke B., Husar G., Janjic N., Jarvis T., Jennings S., Katilius E., Keeney T.R., Kim N., Koch T.H., Kraemer S., Kroiss L., Le N., Levine D., Lindsey W., Lollo B., Mayfield W., Mehan M., Mehler R., Nelson S.K., Nelson M., Nieuwlandt D., Nikrad M., Ochsner U., Ostroff R.M., Otis M., Parker T., Pietrasiewicz S., Resnicow D.I., Rohloff J., Sanders G., Sattin S., Schneider D., Singer B., Stanton M., Sterkel A., Stewart A., Stratford S., Vaught J.D., Vrkljan M., Walker J.J., Watrobka M., Waugh S., Weiss A., Wilcox S.K., Wolfson A., Wolk S.K., Zhang C., Zichi D. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 2010;5(12):e15004. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015004