Определение полисорбата 80 в биофармацевтических препаратах с помощью оптимизированной колориметрической методики

Цели. В данной работе была усовершенствована ранее разработанная методика определения полисорбата 80 в биотехнологических препаратах (дарбэпоэтин альфа, экулизумаб), а также проведена ее валидация.

Методы. Полисорбат извлекали из пробы осаждением белка органическим растворителем, затем выпаривали супернатант в вакууме. Полисорбат дериватизировали оптимизированным железо–тиоцианатным реагентом; дериват экстрагировали в слой органического растворителя и измеряли оптическую плотность.

Результаты. Были установлены оптимальные условия для каждой стадии методики. Правильность находится в диапазоне степени извлечения 97–102%, относительное стандартное отклонение составляет не более 5%, предел количественного определения методики 0.01 мг/мл.

Выводы. Представленная методика имеет высокую чувствительность. Извлечение и определение полисорбата не зависят от матрикса пробы – прежде всего, от присутствующего белка.

1. Askretkov A.D., Isaykina P.M., Cherepushkin S.A., Orlova N.V. Determination of polysorbates by spectrophotometry in drugs based on recombinant proteins. Drug development & registration. 2017;(3):124-129 (in Russ.).

2. Hillgren A., Lindgren J., Aldén M. Protection mechanism of Tween 80 during freeze-thawing of a model protein, LDH. Int. J. Pharm. 2002;237(1-2):57-69. https://doi.org/10.1016/s0378-5173(02)00021-2

3. Arakawa T., Kita Y. Protection of bovine serum albumin from aggregation by Tween 80. J. Pharm. Sci. 2000;89(5):646-651. https://doi.org/10.1002/(SICI)1520-6017(200005)89:5%3C646::AID-JPS10%3E3.0.CO;2-J

4. Kiese S., Pappenberger A., Friess W., Mahler H.C. Shaken, not stirred: mechanical stress testing of an IgG1 antibody. J. Pharm. Sci. 2008;97(10):4347-4366. https://doi.org/10.1002/jps.21328

5. Kerwin B.A. Polysorbates 20 and 80 used in the formulation of protein biotherapeutics: structure and degradation pathways. J. Pharm. Sci. 2008;97(8):2924-2935. https://doi.org/10.1002/jps.21190

6. Kreilgaard L., Jones L.S., Randolph T.W., Frokjaer S., Flink J.M., Manning M.C., Carpenter J.F. Effect of Tween 20 on freeze-thawing- and agitation-induced aggregation of recombinant human factor XIII. J. Pharm. Sci. 1998;87(12):1597-1603. https://doi.org/10.1021/js980126i

7. Wang W., Wang Y.J., Wang D.Q. Dual effects of Tween 80 on protein stability. Int. J. Pharm. 2008;347(1-2):31-38. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2007.06.042

8. Tani T.H., Moore J.M., Patapoff T.W. Single step method for the accurate concentration determination of polysorbate 80. J. Chromatogr. A. 1997;786(1):99-106. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(97)00540-2

9. Ilko D., Braun A., Germershaus O., Meinel L., Holzgrabe U. Fatty acid composition analysis in polysorbate 80 with high performance liquid chromatography coupled to charged aerosol detection. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2015;94:569-574. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2014.11.018

10. Őszi Z., Pethő G. Quantitative determination of polysorbate 20 in nasal pharmaceutical preparations by highperformance liquid chromatography. J. Pharm. Biomed. Anal. 1998;18(4-5):715-720. https://doi.org/10.1016/S0731-7085(98)00265-9

11. Adamo M., Dick L.W. Jr., Qiu D., Lee A.H., Devincentis J., Cheng K.C. A simple reversed phase highperformance liquid chromatography method for polysorbate 80 quantitation in monoclonal antibody drug products. J. Chromatogr. B. 2010;878(21):1865-1870. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2010.04.039

12. Puschmann J., Evers D.H., Müller-Goymann C.C., Herbig M.E. Development of a design of experiments optimized method for quantification of polysorbate 80 based on oleic acid using UHPLC-MS. J. Chromatogr. A. 2019;1599:136-143. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.04.015

13. Tomlinson A., Demeule B., Lin B., Yadav S. Polysorbate 20 Degradation in Biopharmaceutical Formulations: Quantification of Free Fatty Acids, Characterization of Particulates, and Insights into the Degradation Mechanism. Mol. Pharm. 2015;12(11):3805-3815. https://doi.org/10.1021/acs.molpharmaceut.5b00311

14. Wei Z., Bilbulian S., Li J., Pandey R., O’Connor E., Casas-Finet J., Cash P.W. Universal method for the determination of nonionic surfactant content in the presence of protein. J. Sep. Sci. 2015;38(8):1318-1325. https://doi.org/10.1002/jssc.201400766

15. Kim J., Qiu J. Quantitation of low concentrations of polysorbates in high protein concentration formulations by solid phase extraction and cobalt-thiocyanate derivatization. Anal. Chim. Acta. 2014;806:144-151. https://doi.org/10.1016/j.aca.2013.11.005

16. Savjani N., Babcock E., Khor H.K., Raghani A. Use of ferric thiocyanate derivatization for quantification of polysorbate 80 in high concentration protein formulations. Talanta. 2014;130:542-546. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2014.07.052

17. Cucakovich N.B. Determination of Tween 80 in tissue culture media, vaccines, and related products. Anal. Biochem. 1971;40(1):183-186. https://doi.org/10.1016/0003-2697(71)90090-X

18. Khossravi M., Kao Y.H., Mrsny R.J., Sweeney T.D. Analysis methods of polysorbate 20: A new method to assess the stability of polysorbate 20 and established methods that may overlook degraded polysorbate 20. Pharm. Res. 2002;19(5):634-639. https://doi.org/10.1023/a:1015306112979

19. Brito R.M., Vaz W.L. Determination of the critical micelle concentration of surfactants using the fluorescent probe N-phenyl-1-naphthylamine. Anal. Biochem. 1986;152(2):250-255. https://doi.org/10.1016/0003-2697(86)90406-9

20. Yokoyama Y., Atsumi H., Yoshida S., Sone N., Ueda K. Conformational Study for Ionic Aggregates of Poly(oxyethylene) Dodecyl Ethers with Ferric-Thiocyanate Anion through the Intermediary of Potassium Ion. Anal. Sci. 2010;26:1047-1052. https://doi.org/10.2116/analsci.26.1047

21. Yokoyama Y., Hirajima R., Morigaki K., Yamaguchi Y., Ueda K. Alkali-cation affinities of polyoxyethylene dodecylethers and helical conformations of their cationized molecules studied by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2007;18(11):1914-1920. https://doi.org/10.1016/j.jasms.2007.08.004