One-pot определение аминокислот в лекарственных препаратах методом предколоночной дериватизации с фенилизотиоцианатом
https://doi.org/10.32362/2410-6593-2024-19-2-127-138
Аннотация
Цели. Разработать новую методику определения аминокислот в лекарственных препаратах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с предколоночной дериватизацией фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) с применением one-pot пробоподготовки.
Методы. Исходные стандартные растворы аминокислот готовили методом навесок с последующим растворением в воде, после чего готовили рабочие растворы: стандартный, испытуемый и холостой, путем разведения в 20 мМ соляной кислоте. Дальнейшая пробоподготовка осуществлялась в полипропиленовых пробирках Safe-lock (Eppendorf) в реакционном буфере, содержащем подвижную фазу А, ацетонитрил и триэтиламин в соотношении 85 : 10 : 5 с окрашиванием 5% раствором ФИТЦ в ацетонитриле. После тщательного перемешивания в течение 3–5 мин на вортексе пробирки выдерживали в твердотельном термостате с термоизоляционной крышкой в течение 2 ч. Далее пробы охлаждали в течение 10 мин, центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в виалы и проводили разделение смеси аминокислот методом ОФ ВЭЖХ с использованием в качестве неподвижной фазы гидрофобного силикагеля с привитыми группами С18. Количественное определение дериватов аминокислот проводили с применением диодно-матричного детектора.
Результаты. Разработана и валидирована новая методика разделения и определения аминокислот в лекарственных препаратах, позволяющая на основе простой one-pot пробоподготовки с использованием доступных реактивов и оборудования проводить исследования без использования коммерческих наборов, например AccQ×Tag Ultra Derivatization Kit, США. На примере анализа смесей гистидина и глицина показано, что при использовании двух подвижных фаз удается достичь приемлемого разделения дериватов аминокислот в градиентном режиме в течение 20 мин со скоростью потока 1.0 мл/мин. Приготовленные по новой методике пробы продемонстрировали высокую стабильность в применении и хранении. Предложен состав подвижных фаз А и Б, состоящий из 10 мМ ацетатного буфера с рН 3.5 и 80% раствора ацетонитрила. Валидация разработанной методики при анализе лекарственного препарата Иннонафактор®, содержащего в качестве вспомогательных веществ глицин и гистидин, продемонстрировала высокую сходимость результатов количественного определения данных аминокислот.
Выводы. Новая методика определения аминокислот в лекарственных препаратах методом ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ФИТЦ обладает широким диапазоном применения, имеет ряд преимуществ по сравнению с импортными коммерческими наборами для определения аминокислот: низкую стоимость реактивов и материалов, высокую точность и повторяемость, в связи с чем она может быть рекомендована к использованию в лабораториях контроля качества фармацевтических предприятий.
Об авторах
П. А. КалмыковРоссия
Калмыков Павел Алексеевич, к.х.н., ведущий специалист группы переноса и валидации аналитических методик, АО «Генериум»
Scopus Author ID 55502543100,
ReseacherID M-8148-2014
601125, Россия, Владимирская обл., Петушинский район, пос. Вольгинский, ул. Владимирская, д. 14
Т. П. Кустова
Россия
Кустова Татьяна Петровна, д.х.н., профессор, директор Института математики, информационных технологий и естественных наук; заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной химии
Scopus Author ID 6603679916,
ReseacherID F-9318-2013,
153025, Россия, г. Иваново, ул. Ермака, д. 39
С. О. Кустов
Россия
Кустов Станислав Олегович, студент, ФГБОУ ВО «Ивановский государственный университет»; стажер группы переноса и валидации аналитических методик, АО «Генериум»
153025, Россия, г. Иваново, ул. Ермака, д. 39;
601125, Россия, Владимирская обл., Петушинский район, пос. Вольгинский, ул. Владимирская, д. 14
П. С. Шестаковская
Россия
Шестаковская Полина Сергеевна, студент, ФГБОУ ВО «Ивановский государственный университет»; специалист по документации группы переноса и валидации аналитических методик, АО «Генериум»
153025, Россия, г. Иваново, ул. Ермака, д. 39;
601125, Россия, Владимирская обл., Петушинский район, пос. Вольгинский, ул. Владимирская, д. 14
Т. Р. Азметов
Россия
Азметов Тимур Рустемович, химик группы переноса и валидации аналитических методик
601125, Россия, Владимирская обл., Петушинский район, пос. Вольгинский, ул. Владимирская, д. 14
А. А. Калмыкова
Россия
Калмыкова Алёна Александровна, старший биохимик группы переноса и валидации аналитических методик
601125, Россия, Владимирская обл., Петушинский район, пос. Вольгинский, ул. Владимирская, д. 14
Список литературы
1. Сломинский П.А., Шадрина М.И. Пептидные лекарственные средства: возможности, перспективы и ограничения. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018;36(1):8–14. https://doi.org/10.18821/0208-0613-2018-36-1-8-14
2. Wahl O., Holzgrabe U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 2016;154:150–163. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2016.03.071
3. Nwachukwu I.D., Aluko R.E. A systematic evaluation of various methods for quantifying food protein hydrolysate peptides. Food Chem. 2019;270:25–31. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.07.054
4. Lamp A., Kaltschmitt M., Lüdtke O. Improved HPLC-method for estimation and correction of amino acid losses during hydrolysis of unknown samples. Anal. Biochem. 2018;543;140–145. https://doi.org/10.1016/j.ab.2017.12.009
5. Полунин К.Е., Федоткина О.С., Полунина И.А., Буряк А.К. Моделирование хроматографического поведения антибактериальных пептидов в условиях ОФ ВЭЖХ. Журн. физ. химии. 2022;96(6):895–903.
6. Кочетова Л.Б., Кустова Т.П., Курицын Л.В. Реакционная способность α-аминокислот при взаимодействии со сложными эфирами в системе вода – 1,4-диоксан. Журн. общей химии. 2018;88(1):84–89.
7. Кустова Т.П., Кочетова Л.Б. Кинетика и механизм сульфонилирования α-аминокислот и дипептидов. Известия Академии наук. Серия химическая. 2019;4:809–816.
8. Кустова Т.П., Кочетова Л.Б., Хачатрян Д.С. Сравнительная реакционная способность в ацилировании дипептидов на основе тирозина и пролина. Журн. орг. химии. 2022;58(4):422–429.
9. Захарова А.М., Гринштейн И.Л., Карцова Л.А. Определение аминокислот в сухом экстракте мозга коров, пробах мяса телят и кур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сорбционные и хроматографические процессы. 2012;12(6):845–853.
10. Тарасова И.С. Иннонафактор – первый отечественный рекомбинантный фактор свертывания крови IX. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2015;14(5):70–75. https://doi.org/10.24287/1726-1708-2015-14-3-70-75
11. Тутельян В.А., Эллер К.И. (ред.). Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи. М.: Династия; 2010. 180 с. ISBN 978-5-98125-073-6
Дополнительные файлы
|
1. Спектры поглощения пиков на хроматограмме стандартного раствора со временем удерживания (а) 7.9; (b) 8.6; (c) 10.4; (d) 10.8 мин | |
Тема | ||
Тип | Исследовательские инструменты | |
Посмотреть
(36KB)
|
Метаданные ▾ |
- Разработана и валидирована новая методика разделения и определения аминокислот в лекарственных препаратах, позволяющая на основе простой one-pot пробоподготовки с использованием доступных реактивов и оборудования проводить исследования без использования коммерческих наборов.
- На примере анализа смесей гистидина и глицина показано, что при использовании двух подвижных фаз удается достичь приемлемого разделения дериватов аминокислот в градиентном режиме в течение 20 мин со скоростью потока 1.0 мл/мин. Приготовленные по новой методике пробы продемонстрировали высокую стабильность в применении и хранении.
- Предложен состав подвижных фаз А и Б, состоящий из 10 мМ ацетатного буфера с рН 3.5 и 80% раствора ацетонитрила.
- Валидация разработанной методики при анализе лекарственного препарата Иннонафактор®, содержащего в качестве вспомогательных веществ глицин и гистидин, продемонстрировала высокую сходимость результатов количественного определения данных аминокислот.
Рецензия
Для цитирования:
Калмыков П.А., Кустова Т.П., Кустов С.О., Шестаковская П.С., Азметов Т.Р., Калмыкова А.А. One-pot определение аминокислот в лекарственных препаратах методом предколоночной дериватизации с фенилизотиоцианатом. Тонкие химические технологии. 2024;19(2):127-138. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2024-19-2-127-138
For citation:
Kalmykov P.A., Kustova T.P., Kustov S.O., Shestakovskaya P.S., Azmetov T.R., Kalmykova A.A. One-pot determination of amino acids in drugs by pre-column derivatization with phenyl isothiocyanate. Fine Chemical Technologies. 2024;19(2):127-138. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2024-19-2-127-138