Действие противовирусных миРНК на выработку цитокинов in vitro

Цели. Оценить динамику уровня экспрессии генов IL-1β и IL-28β (IFN-λ3) в результате комплексного нокдауна некоторых клеточных генов, чьи продукты экспрессии играют важную роль в репродукции вируса гриппа.
Методы. Вируссодержащую жидкость и клеточный лизат отбирали в течение 3-х дней с момента трансфекции и заражения и оценивали интенсивность вирусной репродукции методами титрования по цитопатическому действию. Концентрацию вирусной рибонуклеиновой кислоты (вРНК) и изменение экспрессии IL-1β и IL-28β (IFN-λ3) определяли методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.
Результаты. Использование каждого комплекса малых интерферирующих РНК (миРНК) приводило к снижению вирусной репродукции на 1-е сутки при множественности заражения 0.001. Применение комплексов A (FLT4.2 + Nup98.1) и D (FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205) приводило к снижению вирусного титра на 2.8 lgТЦД50/мл и на 2.1 lgТЦД50/мл относительно применения неспецифической миРНК L2 и вирусного контроля (р ≤ 0.05). результате трансфекции комплексов B (Nup98.1 + Nup205) и C (FLT4.2 + Nup205) вирусный титр также снижался на 1.5 lgТЦД50/мл и 1.8 lgТЦД50/мл соответственно относительно неспецифической миРНК L2 и вирусного контроля (р ≤ 0.05). При проведении ОТ-ПЦР-РВ также было отмечено достоверное уменьшение концентрации вРНК. При использовании комплексов B, C и D концентрация вРНК снижалась на 1-е сутки в 14.5, 4.1 и 15.0 раз соответственно. На 2-е сутки в клетках с комплексами B и D наблюдалось уменьшение концентрации вРНК в 17.1 и 18.3 раз (р ≤ 0.05). Наряду со снижением вирусного титра и вРНК наблюдалось повышение экспрессии генов IL-1β и IL-28β на 1-е сутки при использовании всех комплексов миРНК относительно неспецифического и вирусного контроля (р ≤ 0.05). На 2-е сутки также наблюдалось повышение экспрессии в клетках с комплексами A и D, а на третьи – в клетках с комплексом D (р ≤0.05).
Выводы. Исследование показало, что применение комплексов миРНК приводит к выраженному противовирусному эффекту при одновременном подавлении активности клеточных генов (FLT4, Nup98 и Nup205). Параллельно с этим было выявлено, что при трансфекции комплексов, блокирующих образование продуктов экспрессии, необходимых для вирусной репродукции, повышается уровень экспрессии генов IL-1β и IL-28β. Данные результаты свидетельствуют о том, что используемые миРНК обладают не только противовирусной, но также и иммуномодулирующей активностью, что способствует более эффективному иммунному ответу организма.

1. Пашков Е.А., Коротышева М.О., Пак А.В., Файзулоев Е.Б., Сидоров А.В., Поддубиков А.В., Быстрицкая Е.П., Дронина Ю.Е., Солнцева В.К., Зайцева Т.А., Пашков Е.П., Быков А.С., Свитич О.А., Зверев В.В. Исследование противогриппозной активности комплексов миРНК против клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 на модели in vitro. Тонкие химические технологии. 2022;17(2):140–151. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2022-17-2-140-151

2. Пашков Е.А., Файзулоев Е.Б., Корчевая Е.Р., Ртищев А.А., Черепович Б.С., Сидоров А.В., Поддубиков А.В., Быстрицкая Е.П., Дронина Ю.Е., Быков А.С., Свитич О.А., Зверев В.В. Нокдаун клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 как супрессор вирусной активности гриппа А/WSN/33 (H1N1) в культуре клеток А549. Тонкие химические технологии. 2021;16(6):476–489. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2021-16-6-476-489

3. Sellers S.A., Hagan R.S., Hayden F.G., Fischer W.A. II. The hidden burden of influenza: A review of the extrapulmonary complications of influenza infection. Influenza Other Respir. Viruses. 2017;11(5):372–393. https://doi.org/10.1111/irv.12470

4. Koehler P., Βassetti M., Kochanek M., Shimabukuro-Vornhagen A., Cornely O.A. Intensive care management of influenza-associated pulmonary aspergillosis. Clin. Microbiol. Infect. 2019;25(12):1501–1509. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.04.031

5. Radzišauskienė D., Vitkauskaitė M., Žvinytė K., Mameniškienė R. Neurological complications of pandemic A(H1N1)2009pdm, postpandemic A(H1N1)v, and seasonal influenza A. Βrain Βehav. 2021;11(1):e01916. https://doi.org/10.1002/brb3.1916

6. Kalil A.C., Thomas P.G. Influenza virus-related critical illness: pathophysiology and epidemiology. Crit. Care. 2019;23(1):258. https://doi.org/10.1186/s13054-019-2539-x

7. Plotnikova M.A., Klotchenko S.A., Vasin A.V. Development of a multiplex quantitative PCR assay for the analysis of human cytokine gene expression in influenza A virus-infected cells. J. Immunol. Methods. 2016;430:51–55. https://doi.org/10.1016/j.jim.2016.01.005

8. Wang J., Wu Y., Ma C., Fiorin G., Wang J., Pinto L.H., et al. Structure and inhibition of the drug-resistant S31N mutant of the M2 ion channel of influenza A virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013;110(4):1315–1320. https://doi.org/10.1073/pnas.1216526110

9. Lampejo T. Influenza and antiviral resistance: an overview. Eur. J. Clin. Microβiol. Infect. Dis. 2020;39(7):1201–1208. https://doi.org/10.1007/s10096-020-03840-9

10. Leneva I.A., Russell R.J., Βoriskin Y.S., Hay A.J. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: Implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol. Antiviral Res. 2009;81(2):132–140. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2008.10.009

11. Goldhill D.H., Te Velthuis A.J.W., Fletcher R.A., Langat P., Zambon M., Lackenby A., Βarclay W.S. The mechanism of resistance to favipiravir in influenza. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018;115(45):11613–11618. https://doi.org/10.1073/pnas.1811345115

12. Yang H., Winkler W., Wu X. Interferon Inducer IFI35 regulates RIG-I-mediated innate antiviral response through mutual antagonism with Influenza protein NS1. J. Virol. 2021;95(11):e00283–21. https://doi.org/10.1128/jvi.00283-21

13. Sa Ribero M., Jouvenet N., Dreux M., Nisole S. Interplay between SARS-CoV-2 and the type I interferon response. PLoS Pathog. 2020;16(7):e1008737. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008737

14. Hauser P., Khosla J., Aurora H., Laurin J., Kling M.A., Hill J., Gulati M., Thornton A.J., Schultz R.L., Valentine A.D., Meyers C.A., Howell C.D. A prospective study of the incidence and open-label treatment of interferoninduced major depressive disorder in patients with hepatitis C. Mol. Psychiatry. 2002;7(9):942–947. https://doi.org/10.1038/sj.mp.4001119

15. Han J., Perez J., Schafer A., Cheng H., Peet N., Rong L., et al. Influenza virus: small molecule therapeutics and mechanisms of antiviral resistance. Curr. Med. Chem. 2018;25(38):5115–5127. https://doi.org/10.2174/0929867324666170920165926

16. Fire A.Z. Gene silencing by double-stranded RNA. Cell Death Differ. 2007;14(12):1998–2012. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4402253

17. Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mell C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;391(6669):806–811. https://doi.org/10.1038/35888

18. Estrin M.A., Hussein I.T.M., Puryear W.Β., Kuan A.C., Artim S.C., Runstadler J.A. Host-directed combinatorial RNAi improves inhibition of diverse strains of influenza A virus in human respiratory epithelial cells. PLoS One. 2018;13(5):e0197246. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197246

19. Пашков Е.А., Корчевая Е.Р., Файзулоев Е.Б., Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Ртищев А. А., Поддубиков А.В., Свитич О.А., Зверев В.В. Создание модели изучения противовирусного действия малых интерферирующих РНК in vitro. Санитарный врач. 2022;1. https://doi.org/10.33920/med-08-2201-07

20. Park H.S., Liu G., Thulasi Raman S.N., Landreth S.L., Liu Q., Zhou Y. NS1 Protein of 2009 Pandemic Influenza A Virus Inhibits Porcine NLRP3 Inflammasome-Mediated Interleukin-1 Βeta Production by Suppressing ASC Uβiquitination. J. Virol. 201828;92(8):e00022–18. https://doi.org/10.1128/JVI.00022-18

21. Julkunen I., Melén K., Nyqvist M., Pirhonen J., Sareneva T., Matikainen S. Inflammatory responses in influenza A virus infection. Vaccine. 2000;19(Suppl. 1):S32–S37. https://doi.org/10.1016/S0264-410X(00)00275-9

22. Lee H.K, Loh T.P., Lee C.K., Tang J.W., Chiu L., Koay E.S. A universal influenza A and B duplex real-time RT-PCR assay. J. Med. Virol. 2012;84(10):1646–1651. https://doi.org/10.1002/jmv.23375

23. Piasecka J., Lenartowicz E., Soszynska-Jozwiak M., Szutkowska B., Kierzek R., Kierzek E. RNA Secondary Structure Motifs of the Influenza A Virus as Targets for siRNA-Mediated RNA Interference. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2020;19:627–642. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.12.018