Исследование противогриппозной активности комплексов миРНК против клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 на модели in vitro

Цели. Оценка изменения вирусной активности гриппа A/WSN/33 после комплексного нокдауна комбинаций клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 в культуре легочных кле­ток человека А549.

Методы. Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного поль­зования Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им И.И. Мечникова (Россия). Авторами выполнялась трансфекция комбинаций комплексов миРНК, вызыва­ющих одновременное нарушение экспрессии клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205. В течение трех дней с момента трансфекции и заражения проводился отбор надосадоч­ной жидкости и клеточного лизата для последующего определения интенсивности ви­русной репродукции по методу титрования по цитопатическому действию. Динамику изменения концентрации вирусной рибонуклеиновой кислоты (вРНК) определяли мето­дом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального вре­мени (ОТ-ПЦР-РВ). Для вычисления статистически значимых различий между группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты. При использовании всех комбинаций комплексов малых интерферирую­щих РНК (миРНК) жизнеспособность клеток не снижалась ниже порогового уровня в 70%. В клетках, обработанных комплексом FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 при множественности заражения (Multiplicity of infection, MOI) 0.1 достоверное снижение вирусной репродукции на 1.5 lg отмечалось на первые сутки по отношению к неспецифическому и вирусному контролям. Использование комплексов миРНК при MOI 0.01 приводило к более выражен­ному противовирусному эффекту. Вирусный титр в клетках, обработанных комплек­сами миРНК FLT4.2 + Nup98.1 и Nup98.1 + Nup205 снижался на первые сутки на 1.5 lg. В клетках, обработанных комплексами FLT4.2 + Nup205 и FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 снижался на 1.8 и 2 lg на первые сутки и на 1.8 и 2.5 lg на вторые сутки соответствен­но по отношению к неспецифическому и вирусному контролям. При проведении ОТ-ПЦР-РВ отмечено достоверное снижение концентрации вирусной РНК. При MOI 0.1 снижение ви­русной в 295, 55 и 63 раза отмечался при использовании комплексов миРНК FLT4.2 + Nup98.1, Nup98.1 + Nup205 и FLT4.2 + Nup98.1 + Nup205 соответственно. На вторые сутки сниже­ние вирусной РНК также отмечалось в клетках, обработанных комплексом FLT4.2 + Nup98.1. Снижение вРНК на третьи сутки в 415 раз отмечалось в клетках, обработанных ком­плексом FLT4.2 + Nup205. При MOI 0.01 концентрация вРНК снизилась в 9.5 раз при ис­пользовании комплекса Nup98.1 + Nup205 относительно неспецифического и вирусного контроля.

Выводы. В ходе исследования был показан выраженный противовирусный эффект ком­бинаций миРНК при одновременном подавлении активности клеточных генов (FLT4, Nup98 и Nup205), чьи продукты экспрессии играют важное участие в процессе вирусной репродукции, а также получены оригинальные конструкции комплексов миРНК. Полу­ченные результаты имеют важное значение для создания препаратов для экстренной профилактики и терапии, чье действие основано на механизме РНК-интерференции.

1. Peteranderl C., Herold S., Schmoldt C. Human Influenza Virus Infections. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2016;37(4):487–500. https://doi.org/10.1055/s-0036-1584801

2. Sellers S.A., Hagan R.S., Hayden F.G., Fischer W.A. 2nd. The hidden burden of influenza: A review of the extrapulmonary complications of influenza infection. Influenza Other Respir. Viruses. 2017;11(5):372–393. https://doi.org/10.1111/irv.12470

3. Koehler P., Bassetti M., Kochanek M., Shimabukuro-Vornhagen A., Cornely O.A. Intensive care management of influenza-associated pulmonary aspergillosis. Clin. Microbiol. Infect. 2019;25(12):1501–1509. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2019.04.031

4. Radzišauskienė D., Vitkauskaitė M., Žvinytė K., Mameniškienė R. Neurological complications of pandemic A(H1N1)2009pdm, postpandemic A(H1N1)v, and seasonal influenza A. Brain Behav. 2021;11(1):e01916. https://doi.org/10.1002/brb3.1916

5. Kalil A.C., Thomas P.G. Influenza virus-related critical illness: pathophysiology and epidemiology. Crit. Care. 2019;23(1):258. https://doi.org/10.1186/s13054-019-2539-x

6. Webby R.J., Webster R.G. Emergence of influenza A viruses. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2001;356(1416):1817–1828. https://doi.org/10.1098/rstb.2001.0997

7. Kirby B.J., Symonds W.T., Kearney B.P., Mathias A.A. Pharmacokinetic, Pharmacodynamic, and Drug-Interaction Profile of the Hepatitis C Virus NS5B Polymerase Inhibitor Sofosbuvir. Clin. Pharmacokinet. 2015;54(7):677–690. https://doi.org/10.1007/s40262-015-0261-7

8. Gentile I., Buonomo A.R., Borgia G. Dasabuvir: A Non-Nucleoside Inhibitor of NS5B for the Treatment of Hepatitis C Virus Infection. Rev. Recent Clin. Trials. 2014;9(2):115–123. https://doi.org/10.2174/1574887109666140529222602

9. Magro P., Zanella I., Pescarolo M., Castelli F., Quiros-Roldan E. Lopinavir/ritonavir: Repurposing an old drug for HIV infection in COVID-19 treatment. Biomed. J. 2021;44(1):43–53. https://doi.org/10.1016/j.bj.2020.11.005

10. Han J., Perez J., Schafer A., Cheng H., Peet N., Rong L., Manicassamy B. Influenza Virus: Small Molecule Therapeutics and Mechanisms of Antiviral Resistance. Curr. Med. Chem. 2018;25(38):5115–5127. https://doi.org/10.2174/0929867324666170920165926

11. Castle S.C. Clinical relevance of age-related immune dysfunction. Clin. Infect. Dis. 2000;31(2):578–585. https://doi.org/10.1086/313947

12. Looi Q.H., Foo J.B., Lim M.T., Le C.F., Show P.L. How far have we reached in development of effective influenza vaccine? Int. Rev. Immunol. 2018;37(5):266–276. https://doi.org/10.1080/08830185.2018.1500570

13. Pleguezuelos O., James E., Fernandez A., Lopes V., Rosas L.A., Cervantes-Medina A., Cleath J., Edwards K., Neitzey D., Gu W, Hunsberger S., Taubenberger J.K., Stoloff G., Memoli M.J. Efficacy of FLU-v, a broad-spectrum influenza vaccine, in a randomized phase IIb human influenza challenge study. npj Vaccines. 2020;5(1):22. https://doi.org/10.1038/s41541-020-0174-9

14. Wang F., Chen G., Zhao Y. Biomimetic nanoparticles as universal influenza vaccine. Smart Mater. Med. 2020;1:21–23. https://doi.org/10.1016/j.smaim.2020.03.001

15. Smith M. Vaccine safety: medical contraindications, myths, and risk communication. Pediatr. Rev. 2015;36(6):227–238. https://doi.org/10.1542/pir.36.6.227

16. McManus M.T., Sharp P.A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet. 2002;3(10):737–747. https://doi.org/10.1038/nrg908

17. Пашков Е.А., Файзулоев Е.Б., Свитич О.А., Сергеев О.В., Зверев В.В. Перспектива создания специфических противогриппозных препаратов на основе синтетических малых интерферирующих РНК. Вопросы вирусологии. 2020;65(4):182–190. https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-4-182-190

18. Adams D., Suhr O.B. Patisiran, an investigational RNAi therapeutic for patients with hereditary transthyretinmediated (hATTR) amyloidosis: Results from the phase 3 APOLLO study. Revue Neurologique. 2018;174(S1):S37. https://doi.org/10.1016/j.neurol.2018.01.085

19. Zhao L., Wang X., Zhang X., Liu X., Zhang Y., Zhang S. Therapeutic strategies for acute intermittent porphyria. Intractable & Rare Diseases Research. 2020;9(4):205–216. https://doi.org/10.5582/irdr.2020.03089

20. Van der Ree M.H., et al. Miravirsen dosing in chronic hepatitis C patients results in decreased microRNA-122 levels without affecting other microRNAs in plasma. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 2015;43(1):102–113. https://doi.org/10.1111/apt.13432

21. DeVincenzo J., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS). 2010;107(19):8800–8805. https://doi.org/10.1073/pnas.0912186107

22. Qureshi A., Tantray V.G., Kirmani A.R., Ahangar A.G. A review on current status of antiviral siRNA. Rev. Med. Virol. 2018;28(4):1976. https://doi.org/10.1002/rmv.1976

23. Lesch M., Luckner M., Meyer M., Weege F., Gravenstein I., Raftery M., Sieben C., Martin-Sancho L., Imai-Matsushima A., Welke R.W., Frise R., Barclay W., Schönrich G., Herrmann A., Meyer T.F., Karlas A. RNAi-based small molecule repositioning reveals clinically approved urea-based kinase inhibitors as broadly active antivirals. PLoS Pathog. 201918;15(3):e1007601. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007601

24. Пашков Е.А., Файзулоев Е.Б., Корчевая Е.Р., Ртищев А.А., Черепович Б.С., Сидоров А.В., Поддубиков А.В., Быстрицкая Е.П., Дронина Ю.Е., Быков А.С., Свитич О.А., Зверев В.В. Нокдаун клеточных генов FLT4, Nup98 и Nup205 как супрессор вирусной активности гриппа А/WSN/33 (H1N1) в культуре клеток А549. Тонкие химические технологии. 2021;16(6):476–489. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2021-16-6-476-489

25. Пашков Е.А., Корчевая Е.Р., Файзулоев Е.Б., Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Ртищев А.А., Поддубиков А.В., Свитич О.А., Зверев В.В., Создание модели изучения противовирусного действия малых интерферирующих РНК in vitro. Санитарный врач. 2022;1. https://doi.org/10.33920/med-08-2201-07

26. Lee H.K, Loh T.P., Lee C.K., Tang J.W., Chiu L., Koay E.S. A universal influenza A and B duplex real-time RT-PCR assay. J. Med. Virol. 2012;84(10):1646–1651. https://doi.org/10.1002/jmv.23375

27. Ramakrishnan M.A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J. Virol. 2016;5(2):85–86. https://doi.org/10.5501/wjv.v5.i2.85

28. Estrin M.A., Hussein I.T.M., Puryear W.B., Kuan A.C., Artim S.C., Runstadler J.A. Host-directed combinatorial RNAi improves inhibition of diverse strains of influenza A virus in human respiratory epithelial cells. PLoS One. 2018;13(5):e0197246. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197246

29. Piasecka J., Lenartowicz E., Soszynska-Jozwiak M., Szutkowska B., Kierzek R., Kierzek E. RNA Secondary Structure Motifs of the Influenza A Virus as Targets for siRNA-Mediated RNA Interference. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2020;19:627–642. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2019.12.018