Методика ВЭЖХ для определения полисорбата 80 в препаратах рекомбинантных терапевтических белков

Цели. Определение полисорбата 80 в препаратах терапевтических рекомбинантных белков всегда являлось трудной задачей, ввиду низкого содержания, гетерогенной природы, присутствия белка в препарате, а также отсутствия хромофорных групп у данного аналита. Целью данной работы являлась разработка экспрессной и экономичной методики определения полисорбата 80 в препаратах рекомбинантных моноклональных антител с использованием гидролиза с последующим определением высвобожденной олеиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием.

Методы. В качестве модельных образцов выбраны пять терапевтических рекомбинантных белков. Использован щелочной гидролиз без удаления белка и с его удалением различными способами осаждения для выделения свободных жирных кислот. Полученный гидролизат проанализирован методом ВЭЖХ.

Результаты. Для субстанций моноклональных антител, ввиду высокого содержания белка, требовалось его удаление. В качестве наиболее простого способа удаления выбрана денатурация и последующая преципитация белка, что достигалось путем осаждения антитела органическим растворителем. Был выбран универсальный осадитель (смесь этанола и изопропанола в объемном соотношении 1:1), использование которого позволяло эффективно удалять моноклональное антитело, но в то же время не допускать потерь полисорбата 80. Была разработана экспрессная методика определения полисорбата 80 для субстанций моноклональных антител. Методика определения полисорбата 80 валидирована согласно требованиям International Council for Harmonisation, United States Pharmacopeia и Государственной фармакопеи Российской Федерации.

Выводы. Были проведены испытания условий пробоподготовки для моноклональных антител. Впервые было внедрено осаждение белка этанолом или смесью этанол-изопропанол перед проведением гидролиза и анализом полисорбата 80. Это позволило значительно уменьшить требуемое количество образца для анализа – до 35 мкл, при концентрации полисорбата 80 – 0.05 мг/мл или еще меньше при его большем содержании. Ускоренный гидролиз полисорбата 80 в течение 90 мин является более предпочтительным при проведении анализа в сравнении с продолжительным гидролизом в течение 4–18 ч, описанным в литературе. Впервые была проведена валидация методики пробоподготовки и анализа для моноклональных антител адалимумаб, экулизумаб и инфликсимаб. Высокая прецизионность методики (среднеквадратичное отклонение ≤6.0%), специфичность и удовлетворительные значения правильности (фактор отклика от 96 до 109%), говорят о пригодности методики для определения полисорбата 80 в лекарственных средствах на основе рекомбинантных моноклональных антител.

1. Pinholt C., Hartvig R.A., Medlicott N.J., Jorgensen L. The importance of interfaces in protein drug delivery– why is protein adsorption of interest in pharmaceutical formulations? Expert Opin. Drug Deliv. 2011;8(7):949–964. https://doi.org/10.1517/17425247.2011.577062

2. Singh S.M., Bandi S., Jones D.N.M., Mallela K.M.G. Effect of Polysorbate 20 and Polysorbate 80 on the HigherOrder Structure of a Monoclonal Antibody and Its Fab and Fc Fragments Probed Using 2D Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Pharm. Sci. 2017;106(12):3486–3498. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2017.08.011

3. Crommelin D.J.A., Hawe A., Jiskoot W. Formulation of Biologics Including Biopharmaceutical Considerations (2011) In: Crommelin D.J.A., Sindelar R., Meibohm B. (Eds.). Pharmaceutical Biotechnology. Springer; 2019. P. 83–103. https://doi.org/10.1007/978-3-030-00710-2_5

4. Agarkhed M., O’Dell C., Hsieh M.C., Zhang J., Goldstein J., Srivastava A. Effect of Surfactants on Mechanical, Thermal, and Photostability of a Monoclonal Antibody. AAPS Pharm. Sci. Tech. 2018;19:79–92. https://doi.org/10.1208/s12249-017-0845-7

5. Wang W., Wang Y.J., Wang D.Q. Dual effects of Tween 80 on protein stability. Int. J. Pharm. 2008;347(1–2):31–38. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2007.06.042

6. Hillgren A., Lindgren J., Aldén M. Protection mechanism of Tween 80 during freeze-thawing of a model protein, LDH. Int. J. Pharm. 2002;237(1–2):57–69. https://doi.org/10.1016/s0378-5173(02)00021-2

7. Larson N.R., Wei Y., Prajapati I., et al. Comparison of Polysorbate 80 Hydrolysis and Oxidation on the Aggregation of a Monoclonal Antibody. J. Pharm. Sci. 2020;109(1):633–639. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2019.10.069

8. Lippold S., Koshari S.H.S., Kopf R., Schuller R., Buckel T., Zarraga I.E., Koehn H. Impact of mono- and poly-ester fractions on polysorbate quantitation using mixedmode HPLC-CAD/ELSD and the fluorescence micelle assay. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017;132:24–34. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2016.09.033

9. Ilko D., Braun A., Germershaus O., Meinel A., Holzgrabe U. Fatty acid composition analysis in polysorbate 80 with high performance liquid chromatography coupled to charged aerosol detection. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2015;94:569–574. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2014.11.018

10. Seregin A.S., Orlova N.V., Askretkov A.D., Zybin D.I, Seregin Y.A. Quantification of polysorbate 80 in biopharmaceutical formulations implementing an optimized colorimetric approach. Fine Chem. Tech. 2020;15(3):70–77. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2020-15-3-70-77

11. Savjani N., Babcock E., Khor H.K., Raghani A. Use of ferric thiocyanate derivatization for quantification of polysorbate 80 in high concentration protein formulations. Talanta. 2014;130:542–546. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2014.07.052

12. Dwivedi M., Buske J., Haemmerling F., Blech M., Garidel P. Acidic and alkaline hydrolysis of polysorbates under aqueous conditions: Towards understanding polysorbate degradation in biopharmaceutical formulations. Eur. J. Pharm. Sci. 2020;144:105211. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2019.105211

13. Kishore R.S.K., Pappenberger A., Dauphin I.B., Ross A., Buergi B., Staempfli A., Mahler H.C. Degradation of Polysorbates 20 and 80: Studies on Thermal Autoxidation and Hydrolysis. J. Pharm. Sci. 2011;100(2):721–731. https://doi.org/10.1002/jps.22290

14. Huang Z., Tu C., Liu H., Wang L., Zhu Z., Watanabe I. The composition analysis of free and bonded fatty acids in Polysorbate 80 by on-line two-step pyrolytic methylation-gas chromatography. J. Microchem. 2020;159:105342. https://doi.org/10.1016/j.microc.2020.105342

15. Shende N., Karale A., Bhagade S. Evaluation of a sensitive GC-MS method to detect polysorbate 80 in vaccine preparation. J. Pharm. Biomed. Anal. 2020;183:113126. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113126

16. Mondal B., Kote M., Lunagariya C., Patel M. Development of a simple high performance liquid chromatography(HPLC)/evaporative light scattering detector (ELSD) method todetermine Polysorbate 80 in a pharmaceutical formulation. Saudi Pharma. J. 2020;28(3):325–328. https://doi.org/10.1016/j.jsps.2020.01.012

17. Puschmann J., Evers D.H., Muller-Goymann C.C., Herbig M.E. Development of a Design of Experiments optimized method for quantification of polysorbate 80 based on oleic acid using UHPLC-MS. J. Chromatogr. A. 2019;1599:136–143. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.04.015

18. Wang Z., Wang Y., Tie C., Zhang J. A fast strategy for profiling and identifying pharmaceutic excipient polysorbates by ultra-high performance liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2020;1609:460450. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.460450

19. Tomlinson A., Demeule B., Lin B., Yadav S. Polysorbate 20 Degradation in Biopharmaceutical Formulations: Quantification of Free Fatty Acids, Characterization of Particulates, and Insights into the Degradation Mechanism. Mol. Pharmaceutics. 2015;12(11):3805–3815. https://doi.org/10.1021/acs.molpharmaceut.5b00311

20. Oszi Z., Petho G. Quantitative determination of polysorbate 20 in nasal pharmaceutical preparations by highperformance liquid chromatography. J. Pharm. Biomed. Anal. 1998;18(4–5):715–720. https://doi.org/10.1016/S0731-7085(98)00265-9

21. Adamo M., Dick L.W., Qiu D. A simple reversed phase high-performance liquid chromatography method for polysorbate 80 quantitation in monoclonal antibody drug products. J. Chromatogr. B. 2010;878(21):1865–1970. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2010.04.039

22. Degterev M.B., Badaukayte R.A., Shukurov R.R. A development of high-throughput HPLC method for the polysorbate 80 quantitation in protein therapeutic products. J. Chromatogr. B. 2019;1133:121847. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121847

23. Wei Z., Bilbulian S., Li J., Pandey R., O’Connor E., Casas-Finet J., Cash P.W. Universal method for the determination of nonionic surfactant content in the presence of protein. J. Sep. Sci. 2015;38(8):1318–1325. https://doi.org/10.1002/jssc.201400766

24. Degterev M.B. Method for measuring the quantity of Tween 80 using alkaline hydrolysis of a sample followed by highperformance liquid chromatography: Pat. WO2019117750. Publ. 20.06.2019.

25. Grokhovskii V.I., Bendryshev A.A., Shvets S.V., Orlov D.A., Vaganova O.A. Determination of polysorbates in biotech drugs. Razrabotka i registratsiya lekarstvennykh sredstv = Drug Development & Registration. 2017;2(19):160–165 (in Russ.).

26. Hu M., Niculescu M., Zhang X.M., Hui A. Highperformance liquid chromatographic determination of poly-sorbate 80 in pharm aceutical suspensions. J. Chromatogr. A. 2003;984(2):233–236. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(02)01849-6