Разработка иммунохроматографического анализа для одновременного обнаружения тетрациклинов и стрептомицина в молоке

Цели. Оптимизация стабильности конъюгатов, полученных методом непрямой иммобилизации специфических антител на наночастицах золота (НЧЗ) при помощи антивидовых антител, и разработка на их основе иммунохроматографического анализа (ИХА) для определения антибиотиков в молоке.

Методы. НЧЗ синтезировали восстановлением золотохлористоводородной кислоты в присутствии зародышей. Размер определяли спектрофотометрически по литературным данным на приборе Thermo Fisher Scientific Varioskan LUX. Моноклональные мышиные антитела к тетрациклину и стрептомицину иммобилизовали на поверхности НЧЗ посредством анти-мышиных антител. Конъюгаты бычьего сывороточного альбумина с тетрациклином и стрептомицином получали реакцией Манниха и клик- реакцией соответственно. Степень конъюгации определяли при помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии на приборе Bruker RapifleX. Иммунореагенты наносили на нитроцеллюлозную мембрану на диспенсере BioDot ZX1010. Собранный мультимембранный композит нарезали на тест-полоски на гильотинном резчике KinBio ZQ4500. Результаты ИХА интерпретировали визуально, а также при помощи считывателя тест-полосок Allsheng TSR-100.

Результаты. После получения конъюгатов посредством непрямой иммобилизации при помощи антивидовых антител необходимо проводить блокировку оставшихся незанятыми сайтов связывания антивидовых антител, чтобы повысить стабильность конъюгатов в растворе. В результате оптимизации концентраций иммунореагентов был разработан ИХА для одновременного обнаружения стрептомицина и тетрациклинов в молоке. Предел обнаружения оптимизированного анализа тетрациклинов и стрептомицина составил 2–7.5 и 25 нг/мл при визуальной интерпретации результатов, 0.29–2.15 и 1.34 нг/мл при использовании считывателя тест-полосок соответственно.

Выводы. Установлено, что блокировка свободных сайтов связывания вторичных антител повышает стабильность полученных конъюгатов антител в растворе, предотвращая кросс-сшивки наночастиц, вызываемые связыванием антивидовых антител.

1. Lu N., Chen J., Rao Z., Guo B., Xu Y. Recent Advances of Biosensors for Detection of Multiple Antibiotics. Biosensors (Basel). 2023;13(9):850. https://doi.org/10.3390/bios13090850

2. Панфёров В.Г., Сафенкова И.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Способы повышения чувствительности иммунохроматографических тест-систем с колориметрической детекцией (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2021;57(2):107–116. https://doi.org/10.31857/S0555109921020112

3. Lu Z.Y., Chan Y.H. The importance of antibody orientation for enhancing sensitivity and selectivity in lateral flow immunoassays. Sens. Diagnost. 2024;3(10):1613–1634. https://doi.org/10.1039/D4SD00206G

4. Sabzehmeidani M.M., Kazemzad M. Quantum dots based sensitive nanosensors for detection of antibiotics in natural products: A review. Sci. Total Environ. 2022;810:151997. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.151997

5. Гендриксон О.Д., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Разработка подходов для высокочувствительной иммунохроматографической детекции акватоксинов в воде и пищевых продуктах. В сб.: Балтийский морской форум: материалы Х Международного морского форума. 2022. Т. 4. С. 39–49. https://elibrary.ru/dctmph

6. Liu C., Yang L., Zhang W., Li D., Li L., Wang H., Ma Y., Li C. A magnetic nanoparticle-based lateral flow immunochromatography assay for the rapid detection of fluoroquinolones in milk. Eur. Food Res. Technol. 2021;247(10):2645–2656. https://doi.org/10.1007/s00217-021-03820-z

7. Губайдуллина М.К., Урусов А.Е., Жердев А.В., Чуанлай К., Дзантиев Б.Б. Иммунохроматографические тест-системы с использованием конъюгата антивидовые антитела- коллоидное золото: особенности и возможности на примере определения охратоксина А. Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2018;59(2):144–150.

8. Gan S.Y., Tye G.J., Chew A.L., Ng W.K., Lai N.S. Linkermediated oriented antibody immobilisation strategies for a more efficient immunosensor and diagnostic applications: A review. Biosens. Bioelectron.: X.: 2023;14:100379. https://doi.org/10.1016/j.biosx.2023.100379

9. Barshevskaya L.V., Sotnikov D.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Modular Set of Reagents in Lateral Flow Immunoassay: Application for Antibiotic Neomycin Detection in Honey. Biosensors (Basel). 2023;13(5):498. https://doi.org/10.3390/bios13050498

10. Barshevskaya L.V., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Highly Sensitive Lateral Flow Immunodetection of the Insecticide Imidacloprid in Fruits and Berries Reached by Indirect Antibody–Label Coupling. Foods. 2025;14(1):25. https://doi.org/10.3390/foods14010025

11. Zvereva E.A., Zherdev A.V., Aslamova A.A., Hendrickson O.D., Dzantiev B.B., Eremin S.A. Simple indirect immunochromatographic detection of herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in fresh juices. J. Food Compos. Analys. 2025;140:107236. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2025.107236

12. Hendrickson O.D., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Godjevargova T., Xu C., Dzantiev B.B. Development of a double immunochromatographic test system for simultaneous determination of lincomycin and tylosin antibiotics in foodstuffs. Food Chem. 2020;318:126510.

13. Bartosh A.V., Sotnikov D.V., Hendrickson O.D., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Design of Multiplex Lateral Flow Tests: A Case Study for Simultaneous Detection of Three Antibiotics. Biosensors (Basel). 2020;10(3):17. https://doi.org/10.3390/bios10030017

14. Huong N.T., Huyen H.T., Phong T.Q. Conjugation of tetracycline with carrier proteins and production of its polyclonal antibody for the development of rapid test. Vietnam J. Sci. Technol. 2024;62(1):23–34. https://doi.org/10.15625/2525-2518/17325

15. Kumar D., Mutreja I., Sykes P. Seed mediated synthesis of highly mono-dispersed gold nanoparticles in the presence of hydroquinone. Nanotechnology. 2016;27(35):355601. https://doi.org/10.1088/0957-4484/27/35/355601

16. Максин И.В., Куандыкова А., Лузянин Т.А., Иванов В.С., Кириллова Ю.Г., Хунтеев Г.А. Повышение чувствительности иммунохроматографического анализа для определения пенициллина в молоке за счет ориентированной иммобилизации пенициллин-связывающего белка на поверхности коллоидного золота. Журн. аналитической химии. 2025;80(6):545–557. https://doi.org/10.31857/S0044450225060021

17. Uhrovčík J. Strategy for determination of LOD and LOQ values – Some basic aspects. Talanta. 2014;119:178–180. https://doi.org/10.1016/J.TALANTA.2013.10.061

18. Presolski S.I., Hong V.P., Finn M.G. Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr. Protoc. Chem. Biol. 2011;3(4):153–162. https://doi.org/10.1002/9780470559277.ch110148

19. Буркин М.А., Гальвидис И.А., Кононенко Г.П. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Сообщение VII. Иммуноферментный анализ стрептомицина. Сельскохозяйственная биология. 2012;47(6): 109–115. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2012.6.109rus

20. Bastús N.G., Comenge J., Puntes V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: Size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 2011;27(17):11098–11105. https://doi.org/10.1021/la201938u

21. Zherdev A.V., Zvereva E.A., Taranova N.A., Safenkova I.V., Vostrikova N.L., Dzantiev B.B. Immunochromatographic food control tools: New developments and practical prospects. Theory and Practice of Meat Processing. 2024;9(4):280–295. https://doi.org/10.21323/2414-438X-2024-9-4-280-295

22. Zvereva E.A., Byzova N.A., Sveshnikov P.G., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Cut-off on demand: adjustment of the threshold level of an immunochromatographic assay for chloramphenicol. Anal. Methods. 2015;7(15):6378–6384. https://doi.org/10.1039/c5ay00835b

23. Guo J., Xin J., Wang J., Li Z., Yang J., Yu X., Yan M., Mo J. A high-efficiency and selective fluorescent assay for the detection of tetracyclines. Sci Rep. 2024;14(1):22918. https://doi.org/10.1038/s41598-024-74411-7

24. Han L., Fan Y.Z., Qing M., Liu S.G., Yang Y.Z., Li N.B., Luo H.Q. Smartphones and Test Paper-Assisted Ratiometric Fluorescent Sensors for Semi-Quantitative and Visual Assay of Tetracycline Based on the Target-Induced Synergistic Effect of Antenna Effect and Inner Filter Effect. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2020;12(41):47099–47107. https://doi.org/10.1021/acsami.0c15482

25. Moudgil P., Bedi J.S., Aulakh R.S., Gill J.P.S., Kumar A. Validation of HPLC Multi-residue Method for Determination of Fluoroquinolones, Tetracycline, Sulphonamides and Chloramphenicol Residues in Bovine Milk. Food Anal. Methods. 2019;12(2):338–346. https://doi.org/10.1007/s12161-018-1365-0

26. Chen Y., Kong D., Liu L., Song S., Kuang H., Xu C. Development of an ELISA and Immunochromatographic Assay for Tetracycline, Oxytetracycline, and Chlortetracycline Residues in Milk and Honey Based on the Class-Specific Monoclonal Antibody. Food Anal. Methods. 2016;9(4): 905–914. https://doi.org/10.1007/s12161-015-0262-z

27. Wang X., Li J., Jian D., Zhang Y., Shan Y., Wang S., Liu F. Paper-based antibiotic sensor (PAS) relying on colorimetric indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for quantitative tetracycline and chloramphenicol detection. Sens. Actuators B: Chem. 2021;329:129173. https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.129173

28. Berlina A.N., BartoshA.V., ZherdevA.V., XuC., DzantievB.B. Development of Immunochromatographic Assay for Determination of Tetracycline in Human Serum. Antibiotics. 2018;7(4):99. https://doi.org/10.3390/antibiotics7040099

29. Tian Y., Bu T., Zhang M., Sun X., Jia P., Wang Q., Liu Y., Bai F., Zhao S., Wang L. Metal-polydopamine framework based lateral flow assay for high sensitive detection of tetracycline in food samples. Food Chem. 2021;339:127854. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127854

30. Wang X., Chen C., Waterhouse G.I.N., Qiao X., Xu Z. Ultrasensitive detection of streptomycin in foods using a novel SERS switch sensor fabricated by AuNRs array and DNA hydrogel embedded with DNAzyme. Food Chem. 2022;393:133413. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.133413

31. Shinde S.K., Kim D.Y., SarataleR.G., KadamA.A., SarataleG.D., Syed A., Bahkali A.H., Ghodake G.S. Histidine Functionalized Gold Nanoparticles for Screening Aminoglycosides and Nanomolar Level Detection of Streptomycin in Water, Milk, and Whey. Chemosensors. 2021;9(12):358. https://doi.org/10.3390/chemosensors9120358

32. Roushani M., Ghanbari K. An electrochemical aptasensor for streptomycin based on covalent attachment of the aptamer onto a mesoporous silica thin film-coated gold electrode. Microchim. Acta. 2019;186(2):115. https://doi.org/10.1007/s00604-018-3191-x

33. Jiang J., Luo P., Liang J., Shen X., Lei H., Li X. A highly sensitive and quantitative time resolved fluorescent microspheres lateral flow immunoassay for streptomycin and dihydrostreptomycin in milk, honey, muscle, liver, and kidney. Anal. Chim. Acta. 2022;1192:339360. https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.339360

34. Zhou J., Nie W., Chen Y., Yang C., Gong L., Zhang C., Chen Q., He L., Feng X. Quadruplex gold immunochromatogaraphic assay for four families of antibiotic residues in milk. Food Chem. 2018;256:304–310. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.02.002