chemicallytechFine Chemical TechnologiesТонкие химические технологии2410-65932686-7575MIREA – Russian Technological University (RTU MIREA).10.32362/2410-6593-2017-12-1-64-75chemicallytech-75Research ArticleCHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF MEDICINAL COMPOUNDS AND BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCESХИМИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙAPPROACHES TO CHORIONIC GONADOTROPIN QUANTITATIVE DETERMINATION IN ANTI-DOPING CONTROLКОЛИЧЕСТВЕННОE ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА В ЦЕЛЯХ АНТИДОПИНГОВОГО КОНТРОЛЯЗвереваИ. О.ZverevaI. O.

научный сотрудник отдела пептидного допинга и анализа крови

Moscow, 105005 Russia

zvereva@dopingtest.ruСавельеваН. Б.SavelievaN. B.

старший научный сотрудник отдела пептидного допинга и анализа крови

Moscow, 105005 Russia

noemail@neicon.ruПостниковП. В.PostnikovP. V.

заместитель начальника отдела пептидного допинга и анализа крови

Moscow, 105005 Russia

noemail@neicon.ruЕфимоваЮ. А.EfimovaYu. A.

доцент

Moscow, 119571 Russia

noemail@neicon.ruДикунецМ. А.DikunetsM. A.

директор

Moscow, 105005 Russia

noemail@neicon.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Антидопинговый Центр»РоссияFederal State Budgetary Institution “Antidoping Centre”Russian FederationМосковский технологический университет (Институт тонких химических технологий)РоссияMoscow Technological University (Institute of Fine Chemical Technologies)Russian Federation2017280220171216475Copyright © Zvereva I.O., Savelieva N.B., Postnikov P.V., Efimova Y.A., Dikunets M.A., 20172017Зверева И.О., Савельева Н.Б., Постников П.В., Ефимова Ю.А., Дикунец М.А.Zvereva I.O., Savelieva N.B., Postnikov P.V., Efimova Y.A., Dikunets M.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.finechem-mirea.ru/jour/article/view/75

The article presents the results of the first stage of development of a new quantitative method for human chorionic gonadotropin (hCG) determination by means of ultra-high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) to uncover doping abuse by athletes. The identified tryptic peptides correspond to the most abundant hCG isoforms: the α- and β-subunits, the nicked and β-core fragment of the hormone. Identification and sequencing of specific fragments were performed with the use of nanoLC-MS/MS. A high resolution / high accuracy hybrid mass-spectrometer was applied. Optimization of mass-spectrometric determination of selected specific peptides was accomplished by UPLC-MS/MS. Quantitative evaluation of hCG using specific fragments determination by UPLC-MS/MS allows to detect corresponding hCG isoforms. This significantly increases the method specificity and decreases the probability of false-positive results.

В статье представлены результаты работы, являющейся одним из этапов разработки методики количественного определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) методом сверхвысокопроизводительной высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (СВЭЖХ-МС/МС) для выявления случаев его злоупотребления в качестве допинга спортсменами. В ходе работы идентифицированы триптические пептиды, соответствующие наиболее распространенным изоформам ХГЧ: α- и β-субъединицам, расщепленному и коровому фрагменту β-субъединицы гормона. Идентификация и секвенирование специфических фрагментов выполнены методом наноВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения с использованием высокоточного и чувствительного масс-спектрометра гибридного типа. Проведена оптимизация масс-спектрометрического определения выбранных специфических пептидов методом СВЭЖХ-МС/МС. Количественное определение ХГЧ по специфическим фрагментам методом СВЭЖХ-МС/МС позволяет однозначно детектировать соответствующие изоформы, что значительно повышает специфичность метода и снижает вероятность получения ложноположительного результата.

хорионический гонадотропинХГЧизоформытрипсинолизсверхпроизводительная ВЭЖХмасс-спектрометрияантидопинговый контрольhuman chorionic gonadotropinhCGisoformstrypsinolysisultra-HPLCanti-doping controlmassspectrometryReferencesKicman A.T., Brooks R.V., Cowan D.A. Human chorionic gonadotrophin and sport // Br. J. Sports Med. 1991. V. 25. № 2. P. 73-80.Kicman A.T., Brooks R.V., Cowan D.A. Human chorionic gonadotrophin and sport // Br. J. Sports Med. 1991. V. 25. № 2. P. 73–80.2014 Anti-Doping Testing Figures Report. [Электронный ресурс] - Режим доступа: https://wada-mainprod. s3.amazonaws.com/wada_2014_anti-doping-testingfigures_full-report_en.pdf (дата обращения 25.08.2016).2014 Anti-Doping Testing Figures Report. [Электронный ресурс] – Access mode: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/wada_2014_anti-doping-testingfigures_full-report_en.pdf (date of access 25.08.2016).2013 Anti-Doping Testing Figures Report. [Электронный ресурс] - Режим доступа: https:// wada-main-prod.s3.amazonaws.com/wada_2013_antidoping_testing_figures_report_en.pdf (дата обращения 25.08.2016).2013 Anti-Doping Testing Figures Report. [Electronic resource] – Access mode: https://wadamain-prod.s3.amazonaws.com/wada_2013_antidoping_testing_figures_report_en.pdf (date of access 25.08.2016).2012 Anti-Doping Testing Figures Report. [Электронный ресурс] - Режим доступа: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-2012-Anti-Doping-Testing-Figures-Report-EN.pdf (дата обращения 25.08.2016).2012 Anti-Doping Testing Figures Report. [Electronic resource] – Access mode: https://wada-mainprod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-2012-Anti-Doping-Testing-Figures-Report-EN.pdf (date of access 25.08.2016).Цырлина Е.В., Порошина Т.Е. Хорионический гонадотропин как маркер трофобластической болезни // Практическая онкология. 2008. Т. 9. № 3. С. 150-159.Tsyrlina E.V., Poroshina T.E. Human chorionic gonadotropin as a marker of trophoblastic diseases // Prakticheskaya onkologiya (Practical Oncology). 2008. V. 9. № 3. P. 150–159. (in Russ.).Bogerd J. Ligand-selective determinants in gonadotropin receptors // Mol. Cell Endocrinol. 2007. V. 2. № 260-262. P. 144-152.Bogerd J. Ligand-selective determinants in gonadotropin receptors // Mol. Cell Endocrinol. 2007. V. 2. № 260-262. P. 144–152.The 2016 Prohibited list. [Электронный ресурс] - Режим доступа: https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medicine/prohibited-list (дата обращения 25.08.2016).The 2016 Prohibited list. [Electronic resource] – Access mode: https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medicine/prohibited-list (date of access 25.08.2016).Guidelines reporting & management of urinary human chorionic gonadotrophin (hCG) and luteinizing hormone (LH) findings in male athletes. [Электронный ресурс] - Режим доступа: https://wada-main-prod. s3.amazonaws.com/resources/files/wada-guidelineshcg-lh-findings-v2.0-2015-en.pdf (дата обращения 25.08.2016).Guidelines reporting & management of urinary human chorionic gonadotrophin (hCG) and luteinizing hormone (LH) findings in male athletes. [Electronic resource] – Access mode: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/wada-guidelineshcg-lh-findings-v2.0-2015-en.pdf (date of access 25.08.2016).Lund H., Lovsletten K., Paus E., Halvorsen T.G., Reubsaet L. Immuno-MS based targeted proteomics: highly specific, sensitive, and reproducible human chorionic gonadotropin determination for clinical diagnostics and doping analysis // Anal. Chem. 2012. V. 84. № 18. P. 7926-7932.Lund H., Lovsletten K., Paus E., Halvorsen T.G., Reubsaet L. Immuno-MS based targeted proteomics: highly specific, sensitive, and reproducible human chorionic gonadotropin determination for clinical diagnostics and doping analysis // Anal. Chem. 2012. V. 84. № 18. P. 7926–7932.Liu C.-L., Bowers L.D. Immunoaffinity trapping of urinary human chorionic gonadotropin and its highperformance liquid chromatographic-mass spectrometric confirmation // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1996. V. 687. P. 213-220.Liu C.-L., Bowers L.D. Immunoaffinity trapping of urinary human chorionic gonadotropin and its highperformance liquid chromatographic-mass spectrometric confirmation // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1996. V. 687. P. 213–220.Gam L.H. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles / Ed. J. Prasain. Croatia: InTech, 2012. 788 p.Gam L.H. Tandem Mass Spectrometry – Applications and Principles / Ed. J. Prasain. Croatia: InTech, 2012. 788 p.Gam L.H., Tham S.-Y., Latiff A. Immunoaffinity extraction and tandem mass spectrometric analysis of human chorionic gonadotropin in doping analysis // J. Chromatogr. B. 2003. V. 792. № 2. P. 187-196.Gam L.H., Tham S.-Y., Latiff A. Immunoaffinity extraction and tandem mass spectrometric analysis of human chorionic gonadotropin in doping analysis // J. Chromatogr. B. 2003. V. 792. № 2. P. 187–196.Lund H., Torsetnes S.B., Paus E., Nustad K., Reubsaet L., Halvorsen T.G. Exploring the complementary selectivity of immunocapture and MS detection for the differentiation between hCG isoforms in clinically relevant samples // J. Proteome Res. 2009. V. 8. № 11. P. 5241-5252.Lund H., Torsetnes S.B., Paus E., Nustad K., Reubsaet L., Halvorsen T.G. Exploring the complementary selectivity of immunocapture and MS detection for the differentiation between hCG isoforms in clinically relevant samples // J. Proteome Res. 2009. V. 8. № 11. P. 5241–5252.Woldemariam G.A., Butch A.W. Immunoextraction-tandem mass spectrometry method for measuring intact human chorionic gonadotropin, free β-subunit, and β-subunit core fragment in urine // Clin. Chem. 2014. V. 60. № 8. P. 1089-1097.Woldemariam G.A., Butch A.W. Immunoextraction-tandem mass spectrometry method for measuring intact human chorionic gonadotropin, free β-subunit, and β-subunit core fragment in urine // Clin.Chem. 2014. V. 60. № 8. P. 1089–1097.Stenman U.H., Hotakainen K., Alfthan H. Gonadotropins in doping: pharmacological basis and detection of illicit use // Br. J. Pharmacol. 2008. V. 154. P. 569-583.Stenman U.H., Hotakainen K., Alfthan H. Gonadotropins in doping: pharmacological basis and detection of illicit use // Br. J. Pharmacol. 2008. V. 154. P. 569–583.Alfthan H., Haglund C., Dabek J., Stenman U.H. Concentrations of human choriogonadotropin, its beta-subunit, and the core fragment of the beta-subunit in serum and urine of men and nonpregnant women // Clin. Chem. 1992. V. 38. № 10. P. 1981-1987.Alfthan H., Haglund C., Dabek J., Stenman U.H. Concentrations of human choriogonadotropin, its beta-subunit, and the core fragment of the beta-subunit in serum and urine of men and nonpregnant women // Clin. Chem. 1992. V. 38. № 10. P. 1981–1987.Grenache D.G., Greene D.N., Dighe A.S., Fantz C.R., Hoefner D., McCudden C., Sokoll L., Wiley C.L., Gronowski A.M. Decreased Human Chorionic Gonadotropin (hCG) Results Due to Increased Concentrations of the Free β Subunit and the β Core Fragment in Quantitative hCG Assays // Clin. Chem. 2010. V. 56. № 12. P. 1839-1844.Grenache D.G., Greene D.N., Dighe A.S., Fantz C.R., Hoefner D., McCudden C., Sokoll L., Wiley C.L., Gronowski A.M. Falsely Decreased Human Chorionic Gonadotropin (hCG) Results Due to Increased Concentrations of the Free β Subunit and the β Core Fragment in Quantitative hCG Assays // Clin. Chem. 2010. V. 56. № 12. P. 1839–1844.Pan S., Aebersold R., Chen R., Goodlett D.R., McIntosh M.W., Zhang J., Brentnall T.A. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications // J. Proteome Res. 2009. V. 8. № 2. P. 287-297.Pan S., Aebersold R., Chen R., Goodlett D.R., McIntosh M.W., Zhang J., Brentnall T.A. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications // J. Proteome Res. 2009. V. 8. № 2. P. 287–297.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.