chemicallytechFine Chemical TechnologiesТонкие химические технологии2410-65932686-7575MIREA – Russian Technological University (RTU MIREA).10.32362/2410-6593-2016-11-5-70-80chemicallytech-51Research ArticleCHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF MEDICINAL COMPOUNDS AND BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCESХИМИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙIDENTIFICATION OF EPO-Fс FUSION PROTEIN BY MEANS OF POLYACRYLAMIDE GEL-ELECTROPHORESIS WITH ISOELECTROFOCUSING (IEF-PAGE)AND IN PRESENCE OF SODIUM DODECYLSULPHATE (SDS-PAGE)/ LAUROYLSARCOSINATE (SAR-PAGE) FOR THE PURPOSE OF ANTI-DOPING CONTROLИДЕНТИФИКАЦИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА ЭПО-Fc МЕТОДАМИ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ФОКУСИРОВАНЕИМ (IEF-PAGE) И В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА (SDS-PAGE)/ЛАУРИЛСАРКОЗИНАТА НАТРИЯ (SAR-PAGE) С ЦЕЛЬЮ АНТИДОПИНГОВОГО КОНТРОЛЯПостниковП. В.PostnikovP. V.

старший научный сотрудник отдела пептидного допинга и анализа крови

 

Moscow, 105005 Russia

horemxeb-haos@mail.ruКротовГ. И.KrotovG. I.

начальник отдела пептидного допинга и анализа крови

 

Moscow, 105005 Russia

noemail@neicon.ruЕфимоваЮ. А.EfimovaYu. A.

доцент

Москва, 119571 Россия

Moscow, 119571 Russia

noemail@neicon.ruДикунецМ. А.DikunetsM. A.

директор

 

Moscow, 105005 Russia

noemail@neicon.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Антидопинговый Центр»РоссияFederal State Budgetary Institution “Antidoping Centre”Russian FederationМосковский технологический университет (Институт тонких химических технологий)РоссияMoscow Technological University (Institute of Fine Chemical Technologies)Russian Federation2016281020161157080Copyright © Postnikov P.V., Krotov G.I., Efimova Y.A., Dikunets M.A., 20162016Постников П.В., Кротов Г.И., Ефимова Ю.А., Дикунец М.А.Postnikov P.V., Krotov G.I., Efimova Y.A., Dikunets M.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.finechem-mirea.ru/jour/article/view/51

The article is devoted to develop of an approach for the identification of new stimulator of ematopoiesis, EPO-Fc fusion protein, which is banned by the World Anti-doping Agency (WADA) to use by athletes since it has become doping. Existing methods of qualitative determination of this substances in routine practice of antidoping laboratories such as polyacrylamide gelelectrophoresis in presence of sodium dodecylsulphate (SDS-PAGE) or lauroylsarcosinate (SARPAGE) are insufficiently specific. The article shows the principal possibility of identification of EPO-Fc fusion protein by means of IEF-PAGE in carrier ampholyte-based gels with a pH range 2-6 after Fc-fragment removal via fermentative hydrolysis.It has been shown that the removing of the crystallizable fragment leads to decrease of molecular weight of whole hybrid molecule and to increase its electrophoretic mobility that allows to detect this banned substances with high specificity by existing methods. During the study the enzyme for hydrolytic cleavage and optimum conditions of hydrolysis of EPO-Fc in serum samples were selected.

Статья посвящена разработке подхода по идентификации нового стимулятора кроветворения, гибридного белка ЭПО-Fc, запрещенного Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА) для употребления спортсменами и являющегося допингом. Существующие в рутинной практике антидопинговых лабораторий мира методы качественного определения данного вещества с помощью полиакриламидного гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата (SDS-PAGE) и лаурилсаркозината (SAR-PAGE) натрия недостаточно специфичны. В статье описана принципиальная возможность идентификации ЭПО-Fc методом изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле (IEF-PAGE) с градиентом рН 2-6 после удаления Fc-части молекулы посредством ферментативного гидролиза. Показано, что удаление кристаллизуемого фрагмента приводит к уменьшению молекулярной массы всей гибридной молекулы и увеличению ее электрофоретической подвижности, что позволяет специфично детектировать запрещенное вещество существующими методами. В ходе исследования выбран фермент для гидролитического расщепления ЭПО-Fc и подобраны оптимальные условия гидролиза в образцах сыворотки крови.

гибридный белок ЭПО-Fcферментативный гидролизэлектрофорезфрагмент ЭПО-шарнирантидопинговый контрольfermentative hydrolysisEPO-Fc fusion proteinelectrophoresisEPO-hinge fragmentantidoping controlReferencesBitonti A.J., Dumont J.A., Low S.C., Peters R.T., Kropp K.E., Palombella V. J., Stattel J. M., Lu Y., Tan C.A., Song J.J., Garcia A.M., Simister N.E., Spiekermann G.M., Lencer W.I., Blumberg R.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. Is. 26. P. 9763-9768.Bitonti A.J., Dumont J.A., Low S.C., Peters R.T., Kropp K.E., Palombella V. J., Stattel J. M., Lu Y., Tan C.A., Song J.J., Garcia A.M., Simister N.E., Spiekermann G.M., Lencer W.I., Blumberg R.S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. Is. 26. P. 9763–9768.Патент 7250493 США, В2 / патентообладатель L.H.K. Sun, B.N.C. Sun, C.R.Y. Sun; заявл. 17.12.2004; опубл. 31.07.2007.Patent 7250493 USA, В2 / patent holder L.H.K. Sun, B.N.C. Sun, C.R.Y. Sun; appl. 17.12.2004; publ. 31.07.2007.Патент 20050202538 США, A1 / S. Gillies, J. Way, K.M. Lo; патентообладатель Merck Patent GmbH; заявл. 30.12.2004; опубл. 15.09. 2005.Patent 20050202538 USA, A1 / S. Gillies, J. Way, K.M. Lo; patent holder Merck Patent GmbH; appl. 30.12.2004; publ. 15.09.2005.Патент 8431132 США, B2 / H. Wang, D.U. Yong, R. Zhang, J. Hu, L. Liu; патентообладатель Novagen Holding Corporation; опубл. 30.04.2013.Patent 8431132 USA, B2 / H. Wang, D.U. Yong, R. Zhang, J. Hu, L. Liu; patent holder Novagen Holding Corporation; publ. 30.04.2013.Запрещенный список ВАДА 2016 года [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.rusada.ru/sites/default/files/content/files/Запрещенный%20список%202016%20года(1).pdf. (дата обращения 16.08.2016).Zapreshchennyi spisok WADA 2016 goda [The Prohibit List of WADA 2016] [Electronic resource] – Access mode: http://www.rusada.ru/sites/default/files/content/files/Запрещенный%20список%202016%20года(1).pdf. (16.08.2016).Postnikov P.V., Krotov G.I., Efimova Yu.A., Rodchenkov G.M. // Russ. Chem. Rev. 2016. V. 85. № 2. P. 99-114. DOI: 10.1070/RCR4563.Postnikov P.V., Krotov G.I., Efimova Yu.A., Rodchenkov G.M. // Russ. Chem. Rev. 2016. V. 85. № 2. P. 99–114. DOI: 10.1070/RCR4563.Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. Is. 1. P. 43-50.Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. Is. 1. P. 43–50.Reichel C.,Abzieher F., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. P. 494-504.Reichel C.,Abzieher F., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. P. 494–504.Технический документ ВАДА [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-TD2014EPO-v1-Harmonization-of-Analysis-and-Reporting-of-ESAs-by-Electrophoretic-Techniques-EN.pdf (Дата обращения 11.06.2016).Tekhnicheskyi document WADA [Technical Document of WADA] [Electronic resource]. — Access mode: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-TD2014EPO-v1-Harmonization-of-Analysis-and-Reporting-of-ESAsby-Electrophoretic-Techniques-EN.pdf (Access date 11.06.2016).Reichel C., Thevis M. // Drug Test. Anal. 2012. V. 4. Is. 11. P. 818-829.Reichel C., Thevis M. // Drug Test. Anal. 2012. V. 4. Is. 11. P. 818–829.Postnikov P., Krotov G., Mesonzhnik N., Efimova Y., Rodchenkov G. // Drug Test. Anal. 2015. V. 7. № 11-12. P. 999-1008.Postnikov P., Krotov G., Mesonzhnik N., Efimova Y., Rodchenkov G. // Drug Test. Anal. 2015. V. 7. № 11-12. P. 999–1008.Reichel C. // Drug Test. Anal. 2014. V. 2. P. 603-619.Reichel C. // Drug Test. Anal. 2014. V. 2. P. 603–619.Promega Corporation. IdeS protease protocol. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://worldwide.promega.com/~/media/files/resources/protocols/product%20information%20sheets/n/ides%20protease%20protocol.pdf (дата обращения 18.05.2016)Promega Corporation. IdeS protease protocol. [Electronic resource]. Access mode: http://worldwide.promega.com/~/media/files/resources/protocols/product%20information%20sheets/n/ides%20protease%20protocol.pdf (Access date 18.05.2016)Reichel C., Abzieher F., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. P. 494-504.Reichel C., Abzieher F., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. P. 494–504.Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. № 1. P. 43-50.Reichel C., Kulovics R., Jordan V., Watzinger M., Geisendorfer T. // Drug Test. Anal. 2009. V. 1. № 1. P. 43–50.Dunn M.J. Electrophoresis / Editor M.J. Dunn. Wiley-VCH, Weinheim, 1986. P. 687.Dunn M.J. Electrophoresis / Editor M.J. Dunn. Wiley-VCH, Weinheim, 1986. P. 687.Lasne F. // J. Immunol. Methods. 2003. V. 276. № 1-2. P. 223-226.Lasne F. // J. Immunol. Methods. 2003. V. 276. № 1–2. P. 223–226.MAIIA Diagnostics EPO Purification kit. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://maiiadiagnostics.com/products/epo_purification_kit/(дата обращения 15.02.2016)MAIIA Diagnostics EPO Purification kit. [Electronic resource]. Access mode: http://maiiadiagnostics.com/products/epo_purification_kit/ (Access date 15.02.2016)Lönnberg M., Dehnes Y., Drevin M., Garle M., Lamon S., Leuenberger N., Quach T., Carlsson J. // J. Chromatogr. A. 2010. V. 1217. № 45. P. 7031-7037.Lönnberg M., Dehnes Y., Drevin M., Garle M., Lamon S., Leuenberger N., Quach T., Carlsson J. // J. Chromatogr. A. 2010. V. 1217. № 45. P. 7031–7037.Collin M., Olsen A. // EMBO J. 2001. V. 20. № 12 P. 3046-3055.Collin M., Olsen A. // EMBO J. 2001. V. 20. № 12 P. 3046–3055.Collin M., Olsen A. // Infect. Immun. 2001. V. 69. № 11. P. 7187-7189.Collin M., Olsen A. // Infect. Immun. 2001. V. 69. № 11. P. 7187–7189.Zhang Z., Perrault R., Zhao Y., Ping J. // J. Chromatogr. B. 2016. V. 1020. P. 148-157.Zhang Z., Perrault R., Zhao Y., Ping J. // J. Chromatogr. B. 2016. V. 1020. P. 148–157.Wang A. C., Wang I. Y. // Immunochemistry. 1976. V. 14. P. 197-200.Wang A. C., Wang I. Y. // Immunochemistry. 1976. V. 14. P. 197–200.An Y., Zhang Y., Mueller H.-M., Shameem M., Chen X. // MAbs. 2014. V. 6. № 4. P. 879-893.An Y., Zhang Y., Mueller H.–M., Shameem M., Chen X. // MAbs. 2014. V. 6. № 4. P. 879–893.von Pawel-Rammingen U., Johansson B.P., Björck L. // EMBO J. 2002. V. 21. № 7. P. 1607-1615.von Pawel-Rammingen U., Johansson B.P., Björck L. // EMBO J. 2002. V. 21. № 7. P. 1607–1615.Chevreux G., Tilly N., Bihoreau N. // Anal. Biochem. 2011. V. 415. P. 212-214.Chevreux G., Tilly N., Bihoreau N. // Anal. Biochem. 2011. V. 415. P. 212–214.Wenig K., Chatwell L., von Pawel-Rammingen U., Björck L., Huber R., Sondermann P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 17371-17376.Wenig K., Chatwell L., von Pawel-Rammingen U., Björck L., Huber R., Sondermann P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 17371–17376.Wagner-Rousset E., Janin-Bussat M.-C., Colas O., Excoffier M., Ayoub D., Haeuw J.-F., Rilatt I., Perez M. // MAbs. 2014. V. 6. P. 1-12.Wagner-Rousset E., Janin-Bussat M.-C., Colas O., Excoffier M., Ayoub D., Haeuw J.-F., Rilatt I., Perez M. // MAbs. 2014. V. 6. P. 1–12.Elliott S.D. // J. Exp. Med. 1945. V.81. № 6. P. 573-592.Elliott S.D. // J. Exp. Med. 1945. V.81. № 6. P. 573–592.Burton D.R. // Mol. Immunol. 1985. V. 22. P. 161-206.Burton D.R. // Mol. Immunol. 1985. V. 22. P. 161–206.Adamczyk M., Gebler J.C., Wu J. // J. Immunol. Methods. 2000. V. 237. P. 95-104.Adamczyk M., Gebler J.C., Wu J. // J. Immunol. Methods. 2000. V. 237. P. 95–104.Jefferis R. // Expert Opin. Biol. Ther. 2007. V. 7. № 9. P. 1401-1413.Jefferis R. // Expert Opin. Biol. Ther. 2007. V. 7. № 9. P. 1401–1413.Goetze A.M., Zhang Z., Liu L., Jacobsen F.W., Flynn G.C. // Mol. Immunol. 2011. V. 49. P. 338-352.Goetze A.M., Zhang Z., Liu L., Jacobsen F.W., Flynn G.C. // Mol. Immunol. 2011. V. 49. P. 338–352.Goetze A.M., Liu L., Arroll T., Chu L., Flynn G.C. // Glycobiology. 2012. V. 22. P. 221-234.Goetze A.M., Liu L., Arroll T., Chu L., Flynn G.C. // Glycobiology. 2012. V. 22. P. 221–234.Strand J., Huang C.-T., Xu J. // J. Pharm. Sci. 2013. V. 102. P. 441-453.Strand J., Huang C.–T., Xu J. // J. Pharm. Sci. 2013. V. 102. P. 441–453.Lynaugh H., Li H., Gong B. // MAbs. 2013. V. 5. P. 641-645.Lynaugh H., Li H., Gong B. // MAbs. 2013. V. 5. P. 641–645.Bajla I., Holländer I., Minichmayer M., Gmeiner G., Reichel C. // Comput. Meth. Programs Biomed. 2005. V. 80. P. 246-270.Bajla I., Holländer I., Minichmayer M., Gmeiner G., Reichel C. // Comput. Meth. Programs Biomed. 2005. V. 80. P. 246–270.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.