chemicallytechFine Chemical TechnologiesТонкие химические технологии2410-65932686-7575MIREA – Russian Technological University (RTU MIREA).10.32362/2410-6593-2024-19-5-408-417KLGQRRchemicallytech-2158Research ArticleBIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGYБИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯInvestigation of the substrate properties of fluorescently labeled pyrimidine triphosphates in recombinase polymerase amplificationИсследование субстратных свойств флуоресцентно-меченых пиримидинтрифосфатов в рекомбиназной полимеразной амплификацииhttps://orcid.org/0009-0005-5604-8171ЕпифановА. С.EpifanovA. S.

Епифанов Алексей Сергеевич, лаборант

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Aleksei S. Epifanov, Laboratory Assistant

32, Vavilova ul., Moscow, 119991

alex.E.797@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3308-7133ШершовВ. Е.ShershovV. E.

Шершов Валерий Евгеньевич, научный сотрудник

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Scopus Author ID 55581995700

Valeriy E. Shershov, Researcher

32, Vavilova ul., Moscow, 119991

Scopus Author ID 55581995700

shershov@list.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6043-1182СуржиковС. А.SurzhikovS. A.

Суржиков Сергей Алексеевич, к.х.н., старший научный сотрудник

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Scopus Author ID 7006525454

Sergey A. Surzhikov, Cand. Sci. (Chem.), Senior Researcher

32, Vavilova ul., Moscow, 119991

ssergey77@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5468-4119ЧудиновА. В.ChudinovA. V.

Чудинов Александр Васильевич, к.х.н., заведующий лабораторией

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Scopus Author ID 7003833018

Alexander V. Chudinov, Cand. Sci. (Chem.), Head of the Laboratory

32, Vavilova ul., Moscow, 119991

Scopus Author ID 7003833018

chud@eimb.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9011-134XЛапаС. А.LapaS. A.

Лапа Сергей Анатольевич, к.б.н., старший научный сотрудник

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Scopus Author ID 6603461000

Sergey A. Lapa, Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher

32, Vavilova ul., Moscow, 119991

Scopus Author ID 6603461000

lapa@biochip.ruИнститут молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Российская академия наукРоссияEngelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesRussian Federation202403112024195408417Copyright © Epifanov A.S., Shershov V.E., Surzhikov S.A., Chudinov A.V., Lapa S.A., 20242024Епифанов А.С., Шершов В.Е., Суржиков С.А., Чудинов А.В., Лапа С.А.Epifanov A.S., Shershov V.E., Surzhikov S.A., Chudinov A.V., Lapa S.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.finechem-mirea.ru/jour/article/view/2158

Objectives. To study the substrate properties of Cy5-labeled deoxynucleoside triphosphates of various natures (dU and dC) in the process of incorporation in the DNA chain during recombinase polymerase amplification (RPA).Methods. The work used the real-time RPA method. The method of horizontal electrophoresis was used to control the quality of the amplification products obtained.Results. The influence of the fluorophore structure and linker lengths on the substrate properties for deoxynucleoside triphosphates Cy5-dUTP and Cy5-dCTP was studied. The following values of the substrate efficiency parameters were determined: amplification efficiency (kinetic indicator), normalized product yield, and embedding coefficient.Conclusions. Modified deoxynucleoside triphosphates (dNTP) with long linkers between the fluorophore and the nitrogenous base, as well as between the quaternary ammonium group and the second heterocycle of the fluorophore, showed greater substrate efficiency than fluorescently labeled dNTP with short linkers. The modified dU in each pair demonstrated greater substrate efficiency compared to the modified dC.

Цели. Изучить субстратные свойства трифосфатов дезоксинуклеозидов различной природы (dU и dC), флуоресцентно-меченых красителями цианинового ряда Cy5, при их встраивании в цепь ДНК в процессе рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA).Методы. В работе использовали метод RPA в режиме реального времени. Для контроля качества получаемых продуктов амплификации использовали метод горизонтального электрофореза.Результаты. Исследовано влияние строения флуорофора и длин линкеров между красителем и азотистым основанием нуклеотида, а также вторым гетероциклом флуорофора и четвертичной аммониевой группой, на субстратные свойства для дезоксинуклеозидтрифосфатов Cy5-dUTP и Cy5-dCTP. Определены значения параметров субстратной эффективности: эффективности амплификации (кинетического показателя), а также нормированного выхода продукта и коэффициента встраивания.Выводы. Модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) с длинными линкерами между флуорофором и азотистым основанием нуклеотида, а также между четвертичной аммониевой группой и вторым гетероциклом флуорофора, показывали большую субстратную эффективность, в отличие от флуоресцентно-меченых dNTP с короткими линкерами. Модифицированные dU в каждой паре демонстрировали большую субстратную эффективность по сравнению с модифицированными dC.

рекомбиназная полимеразная амплификацияфлуоресцентно-меченые дезоксинуклеозидтрифосфатыrecombinase polymerase amplificationfluorescently labeled deoxynucleoside triphosphatesИсследование поддержано грантом Российского научного фонда № 22-14-00257.The study was supported by the Russian Science Foundation, grant No. 22-14-00257.ReferencesBoháčová S., Ludvíková L., Poštová Slavětínská L., Vaníková Z., Klán P., Hocek M. Protected 5-(hydroxymethyl)uracil nucleotides bearing visible-light photocleavable groups as building blocks for polymerase synthesis of photocaged DNA. Org. Biomol. Chem. 2018;16(9):1527–1535. https://doi.org/10.1039/c8ob00160jBoháčová S., Ludvíková L., Poštová Slavětínská L., Vaníková Z., Klán P., Hocek M. Protected 5-(hydroxymethyl)uracil nucleotides bearing visible-light photocleavable groups as building blocks for polymerase synthesis of photocaged DNA. Org. Biomol. Chem. 2018;16(9):1527–1535. https:// doi.org/10.1039/c8ob00160jDziuba D., Pohl R., Hocek M. Bodipy-labeled nucleoside triphosphates for polymerase synthesis of fluorescent DNA. Bioconjug. Chem. 2014;25(11):1984–1995. https://doi.org/10.1021/bc5003554Dziuba D., Pohl R., Hocek M. Bodipy-labeled nucleoside triphosphates for polymerase synthesis of fluorescent DNA. Bioconjug. Chem. 2014;25(11):1984–1995. https://doi.org/10.1021/bc5003554Wynne S.A., Pinheiro V.B., Holliger P., Leslie A.G.W. Structures of an Apo and a Binary Complex of an Evolved Archeal B Family DNA Polymerase Capable of Synthesising Highly Cy-Dye Labelled DNA. PLoS ONE. 2013;8(8):e70892. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070892Wynne S.A., Pinheiro V.B., Holliger P., Leslie A.G.W. Structures of an Apo and a Binary Complex of an Evolved Archeal B Family DNA Polymerase Capable of Synthesising Highly Cy-Dye Labelled DNA. PLoS ONE. 2013;8(8):e70892. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070892Ramsay N., Jemth A.S., Brown A., Crampton N., Dear P., Holliger P. CyDNA: Synthesis and Replication of Highly Cy-Dye Substituted DNA by an Evolved Polymerase. J. Am. Chem. Soc. 2010;132(14):5096–5104. https://doi.org/10.1021/ja909180cRamsay N., Jemth A.S., Brown A., Crampton N., Dear P., Holliger P. CyDNA: Synthesis and Replication of Highly Cy-Dye Substituted DNA by an Evolved Polymerase. J. Am. Chem. Soc. 2010;132(14):5096–5104. https://doi.org/10.1021/ja909180cShershov V.E., Lapa S.A., Kuznetsova V.E., Spitsyn M.A., Guseinov T.O., Polyakov S.A., Stomahin A.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. Comparative Study of Novel Fluorescent Cyanine Nucleotides: Hybridization Analysis of Labeled PCR Products Using a Biochip. J. Fluoresc. 2017;27(6):2001–2016. https://doi.org/10.1007/s10895-017-2139-6Shershov V.E., Lapa S.A., Kuznetsova V.E., Spitsyn M.A., Guseinov T.O., Polyakov S.A., Stomahin A.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. Comparative Study of Novel Fluorescent Cyanine Nucleotides: Hybridization Analysis of Labeled PCR Products Using a Biochip. J. Fluoresc. 2017;27(6):2001–2016. https://doi.org/10.1007/s10895-017-2139-6Bertocchi F., Delledonne A., Vargas-Nadal G., Terenziani F., Painelli A., Sissa C. Aggregates of Cyanine Dyes: When Molecular Vibrations and Electrostatic Screening Make the Difference. J. Phys. Chem. C. 2023;127(21):10185–10196. https://doi.org/10.1021/acs.jpcc.3c01253Bertocchi F., Delledonne A., Vargas-Nadal G., Terenziani F., Painelli A., Sissa C. Aggregates of Cyanine Dyes: When Molecular Vibrations and Electrostatic Screening Make the Difference. J. Phys. Chem. C. 2023;127(21):10185–10196. https://doi.org/10.1021/acs.jpcc.3c01253Шершов В.Е., Лапа С.А., Левашова С.А., Шишкин И.Ю., Штылев Г.Ф., Шекалова Е.Ю., Василисков В.А., Заседателев А.С., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В. Синтез флуоресцентно-меченых нуклеотидов для маркирования продуктов изотермической амплификации. Биоорганическая химия. 2023;49(6):649–656. https://doi.org/10.31857/S0132342323050056Shershov V.E., Lapa S.A., Levashova A.I., et al. Synthesis of Fluorescent-Labeled Nucleotides for Labeling of Isothermal Amplification Products. Russ. J. Bioorg. Chem. 2023;49(5):1115–1158. https://doi.org/10.1134/S1068162023050242 [Original Russian Text: Shershov V.E., Lapa S.A., Levashova A.I., Shishkin I.Yu., Shtylev G.F., Shekalova E.Yu., Vasiliskov V.A., Zasedatelev A.S., Kuznetsova V.E., Chudinov A.V. Synthesis of Fluorescent-Labeled Nucleotides for Labeling of Isothermal Amplification Products. Bioorganicheskaya khimiya. 2023;49(6):649–656 (in Russ.). https://doi.org/10.31857/S0132342323050056 ]Telser J., Cruickshank K.A., Morrison L.E., Netzel T.L. Synthesis and characterization of DNA oligomers and duplexes containing covalently attached molecular labels: comparison of biotin, fluorescein, and pyrene labels by thermodynamic and optical spectroscopic measurements. J. Am. Chem. Soc. 1989;111(18):6966–6976. https://doi.org/10.1021/ja00200a011Telser J., Cruickshank K.A., Morrison L.E., Netzel T.L. Synthesis and characterization of DNA oligomers and duplexes containing covalently attached molecular labels: comparison of biotin, fluorescein, and pyrene labels by thermodynamic and optical spectroscopic measurements. J. Am. Chem. Soc. 1989;111(18):6966–6976. https://doi.org/10.1021/ja00200a011Ren X., El-Sagheer A.H., Brown T. Efficient enzymatic synthesis and dual-colour fluorescent labelling of DNA probes using long chain azido-dUTP and BCN dyes. Nucleic Acids Res. 2016;44(8):e79. https://doi.org/10.1093/nar/gkw028Ren X., El-Sagheer A.H., Brown T. Efficient enzymatic synthesis and dual-colour fluorescent labelling of DNA probes using long chain azido-dUTP and BCN dyes. Nucleic Acids Res. 2016;44(8):e79. https://doi.org/10.1093/nar/gkw028Лапа С.А., Волкова О.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Эффективность амплификации и субстратные свойства флуоресцентно-меченных трифосфатов дезоксиуридина в ПЦР с ДНК-полимеразами, не обладающими 3’-5’-экзонуклеазной. Биоорганическая химия. 2019;45(4):392–402. https://doi.org/10.1134/S0132342319040043Lapa S.A., Volkova O.S., Spitsyn M.A., et al. Amplification Efficiency and Substrate Properties of Fluorescently Labeled Deoxyuridine Triphosphates in PCR in the Presence of DNA Polymerases without 3’-5’ Exonuclease Activity. Russ. J. Bioorg. Chem. 2019;45(4):263–272 (in Russ.). https://doi.org/10.1134/S1068162019040046 [Original Russian Text: Lapa S.A., Volkova O.S., Spitsyn M.A., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Guseinov T.O., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. Amplification Efficiency and Substrate Properties of Fluorescently Labeled Deoxyuridine Triphosphates in PCR in the Presence of DNA Polymerases without 3’-5’ Exonuclease Activity. Bioorganicheskaya khimiya. 2019;45(4):392–402 (in Russ.). https://doi.org/10.1134/S0132342319040043 ]Piepenburg O., Williams C.H., Stemple D.L., Armes N.A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006;4(7):e204. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040204Piepenburg O., Williams C.H., Stemple D.L., Armes N.A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006;4(7):e204. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040204Бондарева О.С., Батурин А.А., Миронова А.В. Рекомбиназная полимеразная амплификация: характеристика метода и применение в диагностике инфекционных заболеваний. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2024;101(2):270–280. https://doi.org/10.36233/0372-9311-470Bondareva O.S., Baturin A.A., Mironova A.V. Recombinase polymerase amplification: method’s characteristics and applications in diagnostics of infectious diseases. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2024;101(2):270–280 (in Russ.). https://doi.org/10.36233/0372-9311-470Lobato I.M., O’Sullivan C.K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends Analyt. Chem. 2018;98:19–35. https://doi.org/10.1016/j.trac.2017.10.015Lobato I.M., O’Sullivan C.K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends Analyt. Chem. 2018;98:19–35. https://doi.org/10.1016/j.trac.2017.10.015.Лапа С.А., Мифтахов Р.А., Клочихина Е.С., Аммур Ю.И., Благодатских С.А., Шершов В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Разработка мультиплексной ОТ-ПЦР с иммобилизованными праймерами для идентифика- ции возбудителей инфекционной пневмонии человека. Молекулярная биология. 2021;55(6):944–955. https://doi.org/10.31857/S0026898421050062Lapa S.A., Miftakhov R.A., Klochikhina E.S., et al. Development of Multiplex RT-PCR with Immobilized Primers for Identification of Infectious Human Pneumonia Pathogens. Mol. Biol. 2021;55(6):828–838. https://doi.org/10.1134/S0026893321040063 [Original Russian Text: Lapa S.A., Miftakhov R.A., Klochikhina E.S., Ammour Yu.I., Blagodatskikh S.A., Shershov V.E., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. Development of Multiplex RT-PCR with Immobilized Primers for Identification of Infectious Human Pneumonia Pathogens. Molekulyarnaya biologiya. 2021;55(6):944–955 (in Russ.). https://doi.org/10.31857/S0026898421050062 ]Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. Assumption – free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett. 2003;339(1):62–66. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(02)01423-4Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. Assumption – free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci. Lett. 2003;339(1):62–66. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(02)01423-4

The authors declare that there are no conflicts of interest present.