chemicallytechFine Chemical TechnologiesТонкие химические технологии2410-65932686-7575MIREA – Russian Technological University (RTU MIREA).10.32362/2410-6593-2024-19-5-393-407JSXAYUchemicallytech-2157Research ArticleCHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF MEDICINAL COMPOUNDS AND BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCESХИМИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙIdentification of hypoxene metabolites in urine samples using gas chromatography–tandem mass spectrometry for anti-doping controlИдентификация метаболитов гипоксена в образцах мочи методом газовой хроматографии – тандемной масс-спектрометрии с целью антидопингового контроляhttps://orcid.org/0000-0003-3424-0582ПостниковП. В.PostnikovP. V.

Постников Павел Викторович, к.х.н., начальник отдела допингового контроля

105005, Москва, Елизаветинский пер., д. 10, стр. 1

Scopus Author ID 57021610900

Pavel V. Postnikov, Cand. Sci. (Chem.), Head of the Doping Control Department

10-1, Elizavetinskii per., Moscow, 105005

Scopus Author ID 57021610900

drpavelpostnikov@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0009-7362ПолосинА. В.PolosinA. V.

Полосин Андрей Вячеславович, главный специалист отдела допингового контроля

105005, Москва, Елизаветинский пер., д. 10, стр. 1

Andrey V. Polosin, Chief Specialist of the Doping Control Department

10-1, Elizavetinskii per., Moscow, 105005

polosin@dopingtest.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3988-6043СавельеваН. Б.SavelievaN. B.

Савельева Надежда Борисовна, главный специалист отдела допингового контроля

105005, Москва, Елизаветинский пер., д. 10, стр. 1

Nadezhda B. Savelieva, Chief Specialist of the Doping Control Department

10-1, Elizavetinskii per., Moscow, 105005

savelieva@dopingtest.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2984-2178КурбаткинС. А.KurbatkinS. A.

Курбаткин Сергей Александрович, ассистент кафедры аналитической химии им. И.П. Алимарина

119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86

Sergey A. Kurbatkin, Assistant, I.P. Alimarin Department of Analitical Chemistry

86, Vernadskogo pr., Moscow, 119571

kurbatkins@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3582-0012ЕфимоваЮ. А.EfimovaYu. A.

Ефимова Юлия Александровна, к.х.н., доцент кафедры аналитической химии им. И.П. Алимарина

119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86

Scopus Author ID 25228417800

Yuliya A. Efimova, Cand. Sci. (Chem.), Assistant Professor, I.P. Alimarin Department of Analitical Chemistry

86, Vernadskogo pr., Moscow, 119571

Scopus Author ID 25228417800

efimova_yulia@bk.ruМочаловаЕ. С.MochalovaE. S.

Мочалова Елена Сергеевна, исполняющий обязанности директора

05005, Москва, Елизаветинский переулок, д. 10, стр. 1

Elena S. Mochalova, Acting Director

10-1, Elizavetinskii per., Moscow, 105005

mochalova@dopingtest.ruНациональная антидопинговая лаборатория (Институт), Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова (НАДЛ МГУ)РоссияNational Anti-Doping Laboratory (Institute), M.V. Lomonosov Moscow State University (NADL MSU)Russian FederationМИРЭА – Российский технологических университет (Институт тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова)РоссияMIREA – Russian Technological University (M.V. Lomonosov Institute of Fine Chemical Technologies)Russian Federation202403112024195393407Copyright © Postnikov P.V., Polosin A.V., Savelieva N.B., Kurbatkin S.A., Efimova Y.A., Mochalova E.S., 20242024Постников П.В., Полосин А.В., Савельева Н.Б., Курбаткин С.А., Ефимова Ю.А., Мочалова Е.С.Postnikov P.V., Polosin A.V., Savelieva N.B., Kurbatkin S.A., Efimova Y.A., Mochalova E.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.finechem-mirea.ru/jour/article/view/2157

Objectives. Hypoxen is a drug which possesses antioxidant and antihypoxic effects. It achieves this by increasing the utilization of oxygen by mitochondria, intensifying oxidative phosphorylation, and as a result, improving tissue respiration. Athletes take it during prolonged exercise, in order to increase efficiency and reduce physical overwork. Since 2023, the World Anti-Doping Agency has included the drug in the monitoring program, in the belief that it can be used to gain a competitive advantage. It is thus a candidate for inclusion in the Prohibited List as a potential regulator of the human metabolism. Currently, there are no studies or scientific publications focusing on the identification of hypoxene in biofluids for the purpose of anti-doping control. The aim of this study is to determine the possible metabolites of the drug and their chromato-mass spectrometric characteristics in urine samples using gas chromatography–tandem mass spectrometry (GC–MS/MS) for doping control screening purposes.Methods. Sample preparation of urine samples was carried out using enzymatic hydrolysis, liquid–liquid extraction and derivatization. The GC–MS/MS method was used for analysis. Screening of hypoxene metabolites was carried out in the mode of total ion current after fragmentation of selected parent ions.Results. Three specific metabolites of hypoxene (m/z 342, 300, and 346, including trimethylsilyl derivatives) were identified in urine samples of volunteers (n = 3). They can act as markers for taking the target antihypoxant, and their possible structural formulas are given. The excretion curves of two metabolites with an m/z of 300 and 346 respectively in urine were studied. The maximum concentration is reached after 8–14 and 1.5–6 h, respectively. It was established, that these metabolites are reliably identified in urine 90 h or more after a single dose of the drug.Conclusions. Possible structures of hypoxene metabolites in urine samples from volunteers were determined for the first time and their chromato-mass spectrometric characteristics were established. The approach developed in this study can be used for screening analysis of hypoxene for the purpose of anti-doping control.

Цели. Гипоксен — лекарственный препарат, обладающий антиоксидантным и антигипоксическим эффектами за счет увеличения утилизации митохондриями кислорода, интенсификации окислительного фосфорилирования и, как следствие, улучшения тканевого дыхания. Спортсмены принимают его при длительных нагрузках для увеличения работоспособности и уменьшения физического переутомления. Всемирное антидопинговое агентство с 2023 г. внесло препарат в мониторинговую программу на основании того, что он является потенциальным регулятором метаболизма, т.е. может использоваться для получения конкурентного преимущества и быть претендентом на включение в Запрещенный список. В настоящее время отсутствуют какие-либо исследования и научные публикации по идентификации гипоксена в биожидкостях для антидопингового контроля. В связи с этим, целью работы было определение возможных метаболитов препарата и их хромато-масс спектрометрических характеристик в образцах мочи методом газовой хроматографии – тандемной масс-спектрометрии (ГХ–МС/МС) для скрининг-процедуры допинг-контроля.Методы. Пробоподготовку образцов мочи проводили с применением ферментативного гидролиза, жидкость-жидкостной экстракции и дериватизации. Для анализа использовали метод ГХ–МС/МС. Скрининг метаболитов гипоксена осуществлялся в режиме полного ионного тока после фрагментации выбранных парент-ионов.Результаты. В образцах мочи добровольцев (n = 3) идентифицированы три специфичных метаболита гипоксена (m/z 342, 300 и 346, включая триметилсилил-производные), которые могут выступать в качестве маркеров приема целевого антигипоксанта; приведены их возможные структурные формулы. Изучены кривые выведения двух метаболитов с m/z 300 и m/z 346 с мочой, максимальная концентрация которых достигается спустя 8–14 и 1.5–6 ч соответственно. Установлено, что данные метаболиты надежно идентифицируются в моче спустя 90 ч и более после однократного приема препарата.Выводы. Впервые определены возможные структуры метаболитов гипоксена в образцах мочи добровольцев и установлены их хромато-масс-спектрометрические характеристики. Разработанный подход может быть применен для скринингового анализа с целью антидопингового контроля.

гипоксенметаболитыантигипоксантдопинг-контрольгазовая хроматография/тандемная масс-спектрометрияhypoxenmetabolitesantihypoxantantidoping controlgas chromatography–tandem mass-spectrometry (GC–MS/MS)ReferencesЛевченкова О.С., Новиков В.Е., Пожилова Е.В. Фармакодинамика и клиническое применение антигипоксантов. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2012;10(3):3–12. https://doi.org/10.17816/RCF1033-12Levchenkova O.S., Novikov V.E., Pozhilova E.V. Pharmacodynamics of antihypoxants and their clinical use. Obzory po klinicheskoi farmakologii i lekarstvennoi terapii = Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy. 2012;10(3):3–12 (in Russ.). https://doi.org/10.17816/RCF1033-12Шаталин Ю.В., Наумов А.А., Поцелуева М.М. Сравнительная характеристика антиоксидантных свойств гипоксена и дурохинона методом хемилюминисценции. Биофизика. 2008;53(1):100–106.Shatalin Yu.V., Naumov A.A., Potselueva M.M. A comparison of antioxidant properties of hypoxen and duroquinone by the method of chemiluminescence. Biofizika. 2008;53(1):100–106 (in Russ.).Мурзаева С.В., Белова С.П., Миронова Г.Д. Определение антиоксидантных свойств активаторов митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала с помощью флуоресцентного индикатора Amplex Red. Прикладная биохимия и микробиология. 2013;49(4):345–352. https://doi.org/10.7868/s0555109913040107Murzaeva S.V., Belova S.P., Mironova G.D. Determination of the antioxidant properties of activators of mitochondrial ATP-dependent potassium channels with the Amplex Red fluorescent indicator. Appl. Biochem. Microbiol. 2013;49(4): 333–340. https://doi.org/10.1134/S0003683813040108 [Original Russian Text: Murzaeva S.V., Belova S.P., Mironova G.D. Determination of the antioxidant properties of activators of mitochondrial ATP-dependent potassium channels with the Amplex Red fluorescent indicator. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2013;49(4):345–352 (in Russ.). https://doi.org/10.7868/s0555109913040107 ]Семиголовский Н.Ю. Применение антигипоксантов в остром периоде инфаркта миокарда. Анестезиология и реаниматология. 1998;(2):56–59.Semigolovskii N.Yu. Use of antihypoxants in the acute period of myocardial infarction. Anesteziol. Reanimatol. 1998;(2):56–59 (in Russ.).Иванова Л.А., Павлова М.В., Арчакова Л.И. Антиоксиданты в комбинированной терапии больных хроническим деструктивным туберкулезом легких. Терапевтический архив. 1994;66(11):54–56.Ivanova L.A., Pavlova M.V., Archakova L.I. Antioxidants in the combined therapy of patients with chronic destructive pulmonary tuberculosis. Therapeutic Archive. 1994;66(11):54–56 (in Russ.).Ганапольский В.П., Шабанов П.Д. Метеоадаптогенные свойства антигипоксантов. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009;72(6):36–41.Ganapolskii V.P., Shabanov P.D. Meteoadaptogenic properties of antihypoxic drugs. Eksperimental’naya i Klinicheskaya Farmakologiya. 2009;72(6):36–41 (in Russ.).Долгарева С.А., Сорокин А.В., Конопля Н.А., Бушмина О.Н., Быстрова Н.А., Овод А.И. Использование иммуномодуляторов, антиоксидантов и гепатопротекторов для коррекции нарушений в печени, эритроцитах и иммунной системе при хронической интоксикации этанолом. Биомедицинская химия. 2018;64(4):360–367. http://dx.doi.org/10.18097/PBMC20186404360Dolgareva S.A., Sorokin A.V., Konoplya N.A., Bushmina O.N., Bystrova N.A., Ovod A.I. The use of immunomodulators, antioxidants and hepatoprotectors for the correction of the liver, erythrocites and the immune system disorders in chronic ethanol intoxication. Biomed. Khim. 2018;64(4):360–367 (in Russ.). https://doi.org/10.18097/pbmc20186404360Новиков В.Е., Крюкова Н.О., Новиков А.С. Гастропротекторные свойства мексидола и гипоксена. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010;73(5):15–18.Novikov V.E., Kriukova N.O., Novikov A.S. Gastroprotective properties of mexidol and hypoxen. Eksperimental’naya i Klinicheskaya Farmakologiya. 2010;73(5):15–18 (in Russ.).Чурганов О.А., Гаврилова Е.А. Влияние препарата гипоксен на некоторые показатели психологического, иммунного, биохимического и функционального статуса спортсменов. Вестник спортивной науки. 2009;(1):36–38.Churganov O.A., Gavrilova E.A. Influence of gipoksen supplement on some values of psychological, immune, biochemical and functional status of athletes. Vestnik sportivnoi nauki = Sports Science Bulletin. 2009;(1):36–38 (in Russ.).Загорский А.Л., Калниньш К.К., Торопов Д.К. Смесь поли (1,4-дигидрокси)-фениленов (полигидрохинонов): пат. 2294918 РФ. Заявка № 2005139599/04; заявл. 20.12.2005; опубл. 10.03.2007. https://yandex.ru/patents/doc/RU2294918C1_20070310. Дата обращения 29.01.2024 г.Zagorsky A.L., Kalninsh K.K., Toropov D.K. Mixture of poly-(1,4-dihydroxy)-phenylenes (polyhydroquinones): RF Pat. 2294918. Publ. 10.03.2007 URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2294918C1_20070310. Accessed January 29, 2024.Zagorsky A.L., Kalninsh K.K., Toropov D.K. Mixtures of poly(1,4-dihydroxy)-phenylenes (polyhydroquinones): Pat. WO2007073236. Publ. 28.06.2007. https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=WO2007073236. Дата обращения 02.02.2024 г.Zagorsky A.L., Kalninsh K.K., Toropov D.K. Mixtures of poly(1,4-dihydroxy)-phenylenes (polyhydroquinones): Pat. WO2007073236. Publ. 28.06.2007. https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=WO2007073236. Accessed February 02, 2024.Савельева Н.Б., Ишутенко Г.В., Полосин А.В., Радус Ф.В., Полянский Д.С., Курбаткин С.А., Ефимова Ю.А., Постников П.В. Валидация методики количественного определения наркотических и психотропных веществ в моче методом СВЭЖХ-МС/МС. Тонкие химические технологии. 2022;17(3): 253–267. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2022-17-3-253-267Savelieva N.B., Ishutenko G.V., Polosin A.V., Radus F.V., Polyansky D.S., Kurbatkin S.A., Efimova Yu.A., Postnikov P.V. Validation of a method for the quantitative determination of narcotic and psychotropic substances in urine by UHPLC–MS/MS. Fine Chem. Technol. 2022;17(3):253–267. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2022-17-3-253-267Шойбонов Б.Б., Онтобоев А.Н., Зинченко А.А., Алёшкин В.А. Гипоксен – ингибитор c1q субкомпонента и c1 компонента системы комплемента человека: пат. 2205002 РФ. Заявка № 2002118468/14; заявл. 11.07.2002; опубл. 27.05.2003. https://patents.google.com/patent/RU2205002C1/ru. Дата обращения 05.02.2024 г.Shoibonov B.B., Ontoboev A.N., Zinchenko A.A., Aleshkin V.A. Hypoxen is an Inhibitor of the c1q Subcomponent and c1 Component of the Human Complement System: RF Pat. 2205002. Publ. 27.05.2003. https://patents.google.com/patent/RU2205002C1/ru. Accessed February 05, 2024.James A.M., Cochemé H.M., Smith R.A.J., Murphy M.P. Interactions of mitochondria-targeted and untargeted ubiquinones with the mitochondrial respiratory chain and reactive oxygen species. Implications for the use of exogenous ubiquinones as therapies and experimental tools. J. Biol. Chem. 2005;280(22):21295–21312. https://doi.org/10.1074/jbc.M501527200James A.M., Cochemé H.M., Smith R.A.J., Murphy M.P. Interactions of mitochondria-targeted and untargeted ubiquinones with the mitochondrial respiratory chain and reactive oxygen species. Implications for the use of exogenous ubiquinones as therapies and experimental tools. J. Biol. Chem. 2005;280(22):21295–21312. https://doi.org/10.1074/jbc.M501527200Гришина Е.В., Хаустова Я.В., Погорелова В.Г., Погорелов А.Г., Кузьмич М.К., Маевский Е.И. Ускорение утилизации лактата под влиянием гипоксена после напряженной мышечной работы. Журнал экспериментальной биологии и медицины. 2008;145(2):158–161.Grishina E.V., Khaustova Ya.V., Pogorelova V.G., et al. Accelerated utilization of lactate under the effect of hypoxen after intensive exercise. Bull. Exp. Biol. Med. 2008;145(2): 198–201. https://doi.org/10.1007/s10517-008-0049-y [Original Russian Text: Grishina E.V., Khaustova Ya.V., Pogorelova V.G., Pogorelov A.G., Kuz’mich M.K., Maevskii E.I. Accelerated utilization of lactate under the effect of hypoxen after intensive exercise. Zhurnal eksperimental’noi biologii i meditsiny. 2008;145(2):158–161 (in Russ.).]Мурзаева С.В., Абрамова М.Б., Попова И.И., Гриценко Е.Н., Миронова Г.Д., Лежнев Э.И. Влияние гипоксена на биоэнергетические процессы в митохондриях и активность АТФ-чувствительного калиевого канала. Биофизика. 2010;55(5):814–821.Murzaeva S.V., Abramova M.B., Popova I.I., et al. Effect of hypoxenum on bioenergetic processes in mitochondria and the activity of ATP-sensitive potassium channel. BIOPHYSICS. 2010;55(5):727–732. https://doi.org/10.1134/S0006350910050076 [Original Russian Text: Murzaeva S.V., Abramova M.B., Popova I.I., Gritsenko E.N., Mironova G.D., Lezhnev E.I. Effect of hypoxenum on bioenergetic processes in mitochondria and the activity of ATP-sensitive potassium channel. Biofizika. 2010;55(5):814–821 (in Russ.).]Игнатьев В.А., Петрова И.В., Цветкова Л.Н. Опыт применения гипоксена (Олифена) в лечении пациентов с хронической обструктивной болезнью легких среднетяжелого и тяжелого течения. Terra Medica. 2010;3(62):19–24.Ignat’ev V.A., Petrova I.V., Tsvetkova L.N. Experience with the use of hypoxen (Olyphenum) in the treatment of patients with moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. Terra Medica. 2010;3(62):19–24 (in Russ.).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.