chemicallytechFine Chemical TechnologiesТонкие химические технологии2410-65932686-7575MIREA – Russian Technological University (RTU MIREA).10.32362/2410-6593-2021-16-3-225-231chemicallytech-1710Research ArticleCHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF MEDICINAL COMPOUNDS AND BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCESХИМИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙSpecificities of multi-primer polymerase chain reaction optimization for the detection of infectious pneumonia agents in humanОсобенности оптимизации мультипраймерной ПЦР для выявления возбудителей инфекционной пневмонии человекаhttps://orcid.org/0000-0002-9485-3068КлочихинаЕ. С.KlochikhinaE. S.

Клочихина Екатерина Сергеевна, лаборант

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Ekaterina S. Klochikhina, Laboratory Assistant

32, Vavilova ul., Moscow, 119991 

arctickate@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3308-7133ШершовВ. Е.ShershovV. E.

Шершов Валерий Евгеньевич, научный сотрудник

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Valeriy E. Shershov, Researcher

32, Vavilova ul., Moscow, 119991 

shershov@list.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8204-4132КузнецоваВ. Е.KuznetsovaV. E.

Кузнецова Виктория Евгеньевна, к.х.н., научный сотрудник

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Viktoria E. Kuznetsova, Cand. Sci. (Chem.), Researcher

32, Vavilova ul., Moscow, 119991 

kuzneimb@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-9011-134XЛапаС. А.LapaS. A.

Лапа Сергей Анатольевич, к.б.н., старший научный сотрудник

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Scopus Author ID 6603461000

Sergey A. Lapa, Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher

32, Vavilova ul., Moscow, 119991

Scopus Author ID 6603461000 

lapa@biochip.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5468-4119ЧудиновА. В.ChudinovA. V.

Чудинов Александр Васильевич, к.х.н., заведующий  лабораторией

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Scopus Author ID 7003833018

Alexander V. Chudinov, Cand. Sci. (Chem.), Head of the Laboratory

32, Vavilova ul., Moscow, 119991

Scopus Author ID 7003833018 

chud@eimb.ruИнститут молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наукРоссияEngelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesRussian Federation202122072021163225231Copyright © Klochikhina E.S., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Lapa S.A., Chudinov A.V., 20212021Клочихина Е.С., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Лапа С.А., Чудинов А.В.Klochikhina E.S., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Lapa S.A., Chudinov A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.finechem-mirea.ru/jour/article/view/1710

Objectives. The objectives of this work are the development of a multi-primer system based on the polymerase chain reaction (PCR) aimed at the simultaneous detection of six bacterial pathogens that cause human pneumonia and the determination of the parameters important for the optimization of this multi-primer system, including solid-phase PCR systems (biological microarrays).Methods. To determine the optimal parameters of the system, PCR methods were used in monoplex and multiplex formats.Results. Primers for Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, and Streptococcus pneumoniae detection were designed, and the PCR cycling conditions were optimized. The patterns of primer design for solidphase PCR were revealed.Conclusions. The developed prototype of a system specifically identifies six clinically significant bacterial pathogens. It could be expanded for the analysis of viral and fungal pathogens and used in clinical diagnostics. A prototype of a system for pathogenic agent detection in the immobilized phase (biological microarray) was created.

Цели. Разработка мультипраймерной системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленной на одновременное выявление шести основных бактериальных возбудителей пневмонии человека; выявление параметров и закономерностей, имеющих важное значение для оптимизации мультипраймерной системы, в том числе для разработки систем ПЦР в иммобилизованной фазе (на биологическом микрочипе).Методы. Для определения оптимальных параметров системы использовали методы ПЦР в т.н. «моноплексном» и мультиплексном форматах.Результаты. Сконструированы праймеры, и оптимизирован температурно-временной профиль проведения ПЦР в объеме для выявления Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae и Streptococcus pneumoniae. Выявлены закономерности конструирования праймеров для ПЦР в иммобилизованной фазе.Выводы. Изученные закономерности особенностей оптимизации мультипраймерных систем позволили разработать прототип системы, способной специфично выявлять шесть клинически значимых возбудителей пневмонии человека. Прототип системы может быть расширен для анализа вирусных и грибковых патогенов и применяться в клинической диагностике. Результаты изучения особенностей мультиплексной ПЦР в иммобилизованной фазе привели к созданию прототипа системы для выявления патогенных агентов на биологическом микрочипе.

инфекционная пневмониямультиплексная ПЦРбиочипыCOVID-19infectious pneumoniamultiplex PCRbiochipsCOVID-19Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 20-14-00287.The study was supported by the Russian Science Foundation grant No. 20-14-00287.ReferencesNair G.B., Niederman M.S. Community-acquired pneumonia: an unfinished battle. Med. Clin. North Am. 2011;95(6):1143–1161. https://doi.org/10.1016/j.mcna.2011.08.007Nair G.B., Niederman M.S. Community-acquired pneumonia: an unfinished battle. Med. Clin. North Am. 2011;95(6):1143–1161. https://doi.org/10.1016/j.mcna.2011.08.007Harris M., Clark J., Coote N., Fletcher P., Harnden A., McKean M., Thomson A. British Thoracic Society Standards of Care Committee. British Thoracic Society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 2011;66:ii1–ii23(Suppl. 2). https://doi.org/10.1136/thoraxjnl-2011-200598Harris M., Clark J., Coote N., Fletcher P., Harnden A., McKean M., Thomson A. British Thoracic Society Standards of Care Committee. British Thoracic Society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 2011;66:ii1–ii23(Suppl. 2). https://doi.org/10.1136/thoraxjnl-2011-200598Rawson T.M., Wilson R.C., Holmes A. Understanding the role of bacterial and fungal infection in COVID-19. Clin. Microbiol. Infect. 2021;27(1):9–11. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2020.09.025Rawson T.M., Wilson R.C., Holmes A. Understanding the role of bacterial and fungal infection in COVID-19. Clin. Microbiol. Infect. 2021;27(1):9–11. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2020.09.025Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., Авдеев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А., Рачина С.А., Фесенко О.В. Российское респираторное общество (РРО) Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ) Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике тяжелой внебольничной пневмонии у взрослых. Пульмонология. 2014;(4):13–48. https://doi.org/10.18093/0869-0189-2014-0-4-13-48 [Chuchalin A.G., Sinopal’nikov A.I., Kozlov R.S., Avdeev S.N., Tyurin I.E., Rudnov V.A., Rachina S.A., Fesenko O.V. Russian Respiratory Society Interregional association on clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy Clinical guidelines on diagnosis, treatment and prevention of severe community acquired pneumonia in adults. PULMONOLOGIYA. 2014;(4):13–48 (in Russ.). https://doi.org/10.18093/0869-0189-2014-0-4-13-48Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С., Авдеев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А., Рачина С.А., Фесенко О.В. Российское респираторное общество (РРО) Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ) Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике тяжелой внебольничной пневмонии у взрослых. Пульмонология. 2014;(4):13–48. https://doi.org/10.18093/0869-0189-2014-0-4-13-48 [Chuchalin A.G., Sinopal’nikov A.I., Kozlov R.S., Avdeev S.N., Tyurin I.E., Rudnov V.A., Rachina S.A., Fesenko O.V. Russian Respiratory Society Interregional association on clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy Clinical guidelines on diagnosis, treatment and prevention of severe community acquired pneumonia in adults. PULMONOLOGIYA. 2014;(4):13–48 (in Russ.). https://doi.org/10.18093/0869-0189-2014-0-4-13-48Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний. Клинич. Микробиол. и Антимикроб. Химиотер. 2000;2(1):60–68. URL: https://cmac-journal.ru/publication/2000/1/cmac-2000-t02-n1-p060/cmac-2000-t02-n1-p060.pdf [Tartakovskii I.S. Modern approaches to the diagnosis of atypical pneumonia. Klin. Mikrobiol. Antimikrob. Khimioterap. = Clin. Microbiol. Antimicrob. Chemotherapy. 2000;2(1):60–68 (in Russ.). Available from URL: https://cmac-journal.ru/en/publication/2000/1/cmac-2000-t02-n1-p060/cmac-2000-t02-n1-p060.pdf]Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний. Клинич. Микробиол. и Антимикроб. Химиотер. 2000;2(1):60–68. URL: https://cmac-journal.ru/publication/2000/1/cmac-2000-t02-n1-p060/cmac-2000-t02-n1-p060.pdf [Tartakovskii I.S. Modern approaches to the diagnosis of atypical pneumonia. Klin. Mikrobiol. Antimikrob. Khimioterap. = Clin. Microbiol. Antimicrob. Chemotherapy. 2000;2(1):60–68 (in Russ.). Available from URL: https://cmac-journal.ru/en/publication/2000/1/cmac-2000-t02-n1-p060/cmac-2000-t02-n1-p060.pdf]Бруснигина Н.Ф., Мазепа В.Н., Самохина Л.П. и др. Этиологическая структура внебольничной пневмонии. Мед. Альманах. 2009;2(7):118–121. [Brusnigina N.F., Mazepa V.N., Samokhina L.P., et al. Etiological structure of community-acquired pneumonia. Med. Al’manakh = Med. Alm. 2009;2(7):118–121 (in Russ.).]Бруснигина Н.Ф., Мазепа В.Н., Самохина Л.П. и др. Этиологическая структура внебольничной пневмонии. Мед. Альманах. 2009;2(7):118–121. [Brusnigina N.F., Mazepa V.N., Samokhina L.P., et al. Etiological structure of community-acquired pneumonia. Med. Al’manakh = Med. Alm. 2009;2(7):118–121 (in Russ.).]Doyle J.J., Doyle J.L. A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochemical Bullettin. 1987;19(1):11–15.Doyle J.J., Doyle J.L. A Rapid DNA Isolation Procedure for Small Quantities of Fresh Leaf Tissue. Phytochemical Bullettin. 1987;19(1):11–15.Morona J.K., Morona R., Miller D.C., Paton J.C. Streptococcus pneumoniae capsule biosynthesis protein CpsB is a novel manganese-dependent phosphotyrosine-protein phosphatase. J. Bacteriol. 2002;184(2):577–583. https://doi.org/10.1128/JB.184.2.577-583.2002Morona J.K., Morona R., Miller D.C., Paton J.C. Streptococcus pneumoniae capsule biosynthesis protein CpsB is a novel manganese-dependent phosphotyrosine-protein phosphatase. J. Bacteriol. 2002;184(2):577–583. https://doi.org/10.1128/JB.184.2.577-583.2002Liu Y., Cao Y., Wang T., Dong Q., Li J., Niu C. Detection of 12 Common Food-Borne Bacterial Pathogens by TaqMan Real-Time PCR Using a Single Set of Reaction Conditions. Front Microbiol. 2019;10:222. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00222Liu Y., Cao Y., Wang T., Dong Q., Li J., Niu C. Detection of 12 Common Food-Borne Bacterial Pathogens by TaqMan Real-Time PCR Using a Single Set of Reaction Conditions. Front Microbiol. 2019;10:222. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00222Xirogianni A., Tzanakaki G., Karagianni E., Markoulatos P., Kourea-Kremastinou J. Development of a single-tube polymerase chain reaction assay for the simultaneous detection of Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Streptococcus spp. directly in clinical samples. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2009;63(2):121–126. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2008.09.017Xirogianni A., Tzanakaki G., Karagianni E., Markoulatos P., Kourea-Kremastinou J. Development of a single-tube polymerase chain reaction assay for the simultaneous detection of Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Streptococcus spp. directly in clinical samples. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2009;63(2):121–126. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2008.09.017Huletsky A., Giroux R., Rossbach V., Gagnon M., Vaillancourt M., Bernier M., Gagnon F., Truchon K., Bastien M., Picard F.J, van Belkum A., Ouellette M., Roy P.H., Bergeron M.G. New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci. J. Clin. Microbiol. 2004;42(5):1875–1884. https://doi.org/10.1128/JCM.42.5.1875-1884.2004Huletsky A., Giroux R., Rossbach V., Gagnon M., Vaillancourt M., Bernier M., Gagnon F., Truchon K., Bastien M., Picard F.J, van Belkum A., Ouellette M., Roy P.H., Bergeron M.G. New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture of staphylococci. J. Clin. Microbiol. 2004;42(5):1875–1884. https://doi.org/10.1128/JCM.42.5.1875-1884.2004Morrison K.E., Lake D., Crook J., Carlone G.M., Ades E., Facklam R., Sampson J.S. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. J. Clin. Microbiol. 2000;38(1):434–437. https://doi.org/10.1128/jcm.38.1.434-437.2000Morrison K.E., Lake D., Crook J., Carlone G.M., Ades E., Facklam R., Sampson J.S. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. J. Clin. Microbiol. 2000;38(1):434–437. https://doi.org/10.1128/jcm.38.1.434-437.2000Binks M.J., Temple B., Kirkham L.-A., Wiertsema S.P., Dunne E.M., et al. Molecular Surveillance of True Nontypeable Haemophilus influenzae: An Evaluation of PCR Screening Assays. PLoS ONE. 2012;7(3):e34083. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0034083Binks M.J., Temple B., Kirkham L.-A., Wiertsema S.P., Dunne E.M., et al. Molecular Surveillance of True Nontypeable Haemophilus influenzae: An Evaluation of PCR Screening Assays. PLoS ONE. 2012;7(3):e34083. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0034083De Vos D., Lim A.Jr., Pirnay J.P., et al. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes, oprI and oprL. J. Clin. Microbiol. 1997;35(6):1295–1299. https://doi.org/10.1128/jcm.35.6.1295-1299.1997De Vos D., Lim A.Jr., Pirnay J.P., et al. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes, oprI and oprL. J. Clin. Microbiol. 1997;35(6):1295–1299. https://doi.org/10.1128/jcm.35.6.1295-1299.1997Tabatabaei M., Hemati Z., Moezzi M.O., Azimzadeh N. Isolation and identification of Legionella spp. from different aquatic sources in south-west of Iran by molecular &culture methods. Mol. Biol. Res. Commun. 2016;5(4):215–223. https://dx.doi.org/10.22099/mbrc.2016.3858Tabatabaei M., Hemati Z., Moezzi M.O., Azimzadeh N. Isolation and identification of Legionella spp. from different aquatic sources in south-west of Iran by molecular &culture methods. Mol. Biol. Res. Commun. 2016;5(4):215–223. https://dx.doi.org/10.22099/mbrc.2016.3858Turton J.F., Perry C., Elgohari S., Hampton C.V. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific, variable number tandem repeat and virulence gene targets. J. Med. Microbiol. 2010;59(5):541–547. https://doi.org/10.1099/jmm.0.015198-0Turton J.F., Perry C., Elgohari S., Hampton C.V. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific, variable number tandem repeat and virulence gene targets. J. Med. Microbiol. 2010;59(5):541–547. https://doi.org/10.1099/jmm.0.015198-0

The authors declare that there are no conflicts of interest present.