chemicallytechFine Chemical TechnologiesТонкие химические технологии2410-65932686-7575MIREA – Russian Technological University (RTU MIREA).10.32362/2410-6593-2021-16-2-148-155chemicallytech-1698Research ArticleCHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF MEDICINAL COMPOUNDS AND BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCESХИМИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙStudy of the multiple incorporation of modified nucleotides into the growing DNA strandИзучение множественного встраивания модифицированных нуклеотидов в растущую цепь ДНКhttps://orcid.org/0000-0003-1328-771XВолковаО. С.VolkovaO. S.

лаборант, 

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

olechka.volckowa@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5468-4119ЧудиновА. В.ChudinovA. V.

к.х.н., заведующий лабораторией, 

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

https://orcid.org/0000-0002-9011-134XЛапаС. А.LapaS. A.

к.б.н., научный сотрудник.,

119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

lapa@biochip.ruИнститут молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наукРоссияEngelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesRussian Federation202124052021162148155Copyright © Volkova O.S., Chudinov A.V., Lapa S.A., 20212021Волкова О.С., Чудинов А.В., Лапа С.А.Volkova O.S., Chudinov A.V., Lapa S.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.finechem-mirea.ru/jour/article/view/1698Objectives

Objectives. This study investigated the substrate properties of the modified derivatives of triphosphates of purine and pyrimidine deoxynucleosides (5-propynyl-2’-deoxyuridine-5’-triphosphate, 5-propynyl2’-deoxycytidine-5’-triphosphate, 5-methyl-2’-deoxycytidine-5’-triphosphate, and N6-methyl-2’-deoxyadenosine-5’-triphosphate) during their simultaneous incorporation in enzymatic reactions (polymerase chain and primer extension reactions).

Methods

Methods. The real-time polymerase chain and primer extension reactions were used to study the substrate efficiency of modified deoxynucleotide triphosphates. Various pairwise combinations of modified derivatives were used; specially designed synthetic DNA fragments and libraries for the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment technology were used as templates. Reactions were conducted using DNA polymerases: Taq, Vent (exo-), DeepVent (exo-), and KOD XL.

Results

Results. In each case, a pair of compounds (modified dUTP + dCTP, dUTP + dATP, and dCTP + dATP) was selected to study the simultaneous incorporation into the growing DNA strand. The most effective combinations of nucleotides for simultaneous insertion were dU and dC, having 5-propynyl substitution. The Vent (exo-) DNA polymerase was found as the most effective for the modified substrates.

Conclusions

Conclusions. The selected compounds can be used for the enzymatic preparation of modified DNA, including aptamers with extended physicochemical properties. 

Цели

Цели. Целью данной работы является изучение субстратных свойств модифицированных производных трифосфатов дезоксинуклеозидов пуриновой и пиримидиновой природы (5-пропинил-2’-дезоксиуридин-5’-трифосфат, 5-пропинил-2’-дезоксицитидин-5’-трифосфат, 5-метил-2’-дезоксицитидин-5’-трифосфат, N6-метил-2’-дезоксиаденозин-5’-трифосфат) при их одновременном встраивании в процессе ферментативных реакций (полимеразной цепной реакции и реакции удлинения праймера).

Методы

Методы. В работе для изучения субстратной эффективности модифицированных трифосфатов дезоксинуклеозидов использовали методы полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и реакции удлинения праймера. Использовали различные попарные сочетания модифицированных производных, в качестве матриц применяли специальным образом сконструированные синтетические фрагменты ДНК и библиотеки для SELEX. Реакции проводили с применением ДНК-полимераз: Taq, Vent (exo-), DeepVent (exo-) и KOD XL.

Результаты

Результаты. В каждом случае из исследуемых соединений выбирали пару соединений (модифицированные dUTP + dCTP, dUTP + dATP, dCTP + dATP) для изучения одновременного встраивания в растущую цепь ДНК. Найдены наиболее эффективные сочетания нуклеотидов для одновременного встраивания, а именно: dU и dC, имеющие 5-пропинильный заместитель. Также найдена наиболее эффективная (из протестированных) ДНК-полимераза: Vent (exo-).

Выводы

Выводы. Выбранные соединения можно использовать для ферментативного получения модифицированных ДНК, в частности аптамеров с расширенными физико-химическими свойствами. 

модифицированные нуклеотидымодифицированные аптамерыполимеразная цепная реакция в режиме реального времениреакция удлинения праймераmodified aptamersmodified nucleotidesprimer extension reactionreal-time polymerase chain reactionИсследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-04-01217.The study was supported by the Russian Foundation for Basic Research, grant No. 19-04-01217.ReferencesLee K., Rafi M., Wang X., Aran K., Feng X., Lo Sterzo C., et al. In vivo delivery of transcription factors with multifunctional oligonucleotides. Nat. Mater. 2015;14(7):701–706. https://doi.org/10.1038/nmat4269Lee K., Rafi M., Wang X., Aran K., Feng X., Lo Sterzo C., et al. In vivo delivery of transcription factors with multifunctional oligonucleotides. Nat. Mater. 2015;14(7):701–706. https://doi.org/10.1038/nmat4269Smith C.I.E., Zain R. Therapeutic oligonucleotides: state of the art. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2019;59:605–630. https://doi.org/10.1146/annurev-pharmtox-010818-021050Smith C.I.E., Zain R. Therapeutic oligonucleotides: state of the art. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2019;59:605–630. https://doi.org/10.1146/annurev-pharmtox-010818-021050Wandtke T., Wozniak J., Kopinski P. Aptamers in diagnostics and treatments of viral infections. Viruses. 2015;7(2):751–780. https://doi.org/10.3390/v7020751Wandtke T., Wozniak J., Kopinski P. Aptamers in diagnostics and treatments of viral infections. Viruses. 2015;7(2):751–780. https://doi.org/10.3390/v7020751Peinetti A.S., Cerertti H., Mizrahi M., Gonzales G.A., Ramires S.A., Requejo F., et al. Confined gold nanoparticles enhance the detection of small molecules in label free impedance aptasensors. Nanoscale. 2015;7:7763–7769. https://doi.org/10.1039/C5NR01429HPeinetti A.S., Cerertti H., Mizrahi M., Gonzales G.A., Ramires S.A., Requejo F., et al. Confined gold nanoparticles enhance the detection of small molecules in label free impedance aptasensors. Nanoscale. 2015;7:7763–7769. https://doi.org/10.1039/C5NR01429HFaltin B., Zengerle R., von Stetten F. Current methods for fluorescence-based universal sequence-dependent detection of nucleic acids in homogenous assays and clinical applications. Clin.Chem. 2013;59 (11):1567–1582. https://doi.org/10.1373/clinchem.2013.205211Faltin B., Zengerle R., von Stetten F. Current methods for fluorescence-based universal sequence-dependent detection of nucleic acids in homogenous assays and clinical applications. Clin.Chem. 2013;59 (11):1567–1582. https://doi.org/10.1373/clinchem.2013.205211Maier K.E., Levy M. From selection hits to clinical leads progress in aptamer discovery. Mol. Ther. Methods & Clin. Develop. 2016;5:16014. https://doi.org/10.1038/mtm.2016.14Maier K.E., Levy M. From selection hits to clinical leads progress in aptamer discovery. Mol. Ther. Methods & Clin. Develop. 2016;5:16014. https://doi.org/10.1038/mtm.2016.14Hocek M. Synthesis of base-modified 2′-deoxyribonucleoside triphosphates and their use in enzymatic synthesis of modified DNA for applications in bioanalysis and chemical biology. J. Org. Chem. 2014;79(21):9914–992. https://doi.org/10.1021/jo5020799Hocek M. Synthesis of base-modified 2′-deoxyribonucleoside triphosphates and their use in enzymatic synthesis of modified DNA for applications in bioanalysis and chemical biology. J. Org. Chem. 2014;79(21):9914–992. https://doi.org/10.1021/jo5020799Kutyavin I.V. Use of base-modified duplex-stabilizing deoxynucleoside 5’-triphosphates to enhance the hybridization properties of primers and probes in polymerase chain reaction. Biochemistry. 2008;47(51):13666–13673. https://doi.org/10.1021/bi8017784Kutyavin I.V. Use of base-modified duplex-stabilizing deoxynucleoside 5’-triphosphates to enhance the hybridization properties of primers and probes in polymerase chain reaction. Biochemistry. 2008;47(51):13666–13673. https://doi.org/10.1021/bi8017784Rohloff J.C., Gelinas A.D., Jarvis T.C., Ochsner U.A., Schneider D.J., Gold L., Janjic N. Nucleic Acid Ligands with Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diaognostic and Therapeutic Agents. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2014;3(10):e201. https://doi.org/10.1038/mtna.2014.49Rohloff J.C., Gelinas A.D., Jarvis T.C., Ochsner U.A., Schneider D.J., Gold L., Janjic N. Nucleic Acid Ligands with Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diaognostic and Therapeutic Agents. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2014;3(10):e201. https://doi.org/10.1038/mtna.2014.49Tolle F., Mayer G. Dressed for success – applying chemistry to modulate aptamer functionality. Chem. Sci. 2013;4(1):60–67. https://doi.org/10.1039/c2sc21510aTolle F., Mayer G. Dressed for success – applying chemistry to modulate aptamer functionality. Chem. Sci. 2013;4(1):60–67. https://doi.org/10.1039/c2sc21510aGawande B.N., Rohloff J.C., Carter J.D., von Carlowitz I., Zhang C., Schneider D.J., Janjic N. Selection of DNA aptamers with two modified bases. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017;114(11):2898–2903. https://doi.org/10.1073/pnas.1615475114Gawande B.N., Rohloff J.C., Carter J.D., von Carlowitz I., Zhang C., Schneider D.J., Janjic N. Selection of DNA aptamers with two modified bases. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017;114(11):2898–2903. https://doi.org/10.1073/pnas.1615475114Чудинов А.В., Шершов В.Е., Павлов А.С., Волкова О.С., Кузнецова В.Е., Заседателев А.С., Лапа С.А. Одновременное встраивание модифицированных производных dU и dC в растущую цепь ДНК в реакции удлинения праймера и ПЦР. Биоорг. химия. 2020;46(5):546–549. https://doi.org/10.31857/S0132342320050061Chudinov A.V., Shershov V.E., Pavlov A.S., Volkova O.S., Kuznetsova V.E., Zasedatelev A.S., Lapa S.A. Simultaneous incorporation of modified dU and dC derivativesin the growing DNA chain using PEX and PCR. Bioorg. Khimiya = Bioorg. Chemistry. 2020;46(5):546–549 (in Russ.). https://doi.org/10.31857/S0132342320050061Лапа С.А., Ромашова К.С., Спицын М.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Гусейнов Т.О., Заседателева О.А., Радько С.П., Тимофеев Э.Н., Лисица А.В., Чудинов А.В. Получение модифицированных комбинаторных ДНК-библиотек методом ПЦР в обратной эмульсии с последующим разделением цепей. Молекулярная биология. 2018;52(6):984–996. https://doi.org/10.1134/S0026898418060113Lapa S.A., Romashova K.S., Spitsyn M.A., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Guseinov T.O., Zasedateleva O.A., Radko S.P., Timofeev E.N., Lisitsa A.V., Chudinov A.V. Preparation of modified combinatorial DNA libraries via emulsion PCR with subsequent strand separation. Mol. Biol. 2018;52(6):854–864. https://doi.org/10.1134/S0026893318060110 [Original Russian Text: Lapa S.A., Romashova K.S., Spitsyn M.A., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Guseinov T.O., Zasedateleva O.A., Radko S.P., Timofeev E.N., Lisitsa A.V., Chudinov A.V. Preparation of modified combinatorial DNA libraries via emulsion PCR with subsequent strand separation. Molekulyarnaya Biologiya. 2018;52(6):984–996 (in Russ.). https://doi.org/10.1134/S0026898418060113Berman A.J., Kamtekar S., Goodman J.L., Lázaro de Vega M., Blanco L., Salas M., Steitz T.A. Structures of phi29 DNA polymerase complexed with subsreate: the mechanism of translocation in B-family polymerases. EMBO J. 2007;26(14):3494–3505. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601780Berman A.J., Kamtekar S., Goodman J.L., Lázaro de Vega M., Blanco L., Salas M., Steitz T.A. Structures of phi29 DNA polymerase complexed with subsreate: the mechanism of translocation in B-family polymerases. EMBO J. 2007;26(14):3494–3505. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601780Betz K., Malyshev D.A., Lavergne T., Welte W., Diederichs K., Dwyer T.J., Ordoukhanian P., Romesberg F.E., Marx A. KlenTaq polymerase replicates unnatural base pairs by inducing a Watson-Crick geometry. Nat. Chem. Biol. 2012;8(7):612–614. https://doi.org/10.1038/nchembio.966Betz K., Malyshev D.A., Lavergne T., Welte W., Diederichs K., Dwyer T.J., Ordoukhanian P., Romesberg F.E., Marx A. KlenTaq polymerase replicates unnatural base pairs by inducing a Watson-Crick geometry. Nat. Chem. Biol. 2012;8(7):612–614. https://doi.org/10.1038/nchembio.966Hollenstein M. Nucleoside triphosphates – building blocks for the modification of nucleic acids. Molecules. 2012;17(11):13569–13591. https://doi.org/10.3390/molecules171113569Hollenstein M. Nucleoside triphosphates – building blocks for the modification of nucleic acids. Molecules. 2012;17(11):13569–13591. https://doi.org/10.3390/molecules171113569Лапа С.А., Шершов В.Е., Краснов Г.С., Волкова О.С., Кузнецова В.Е., Радько С.П., Заседателев А.С., Чудинов А.В. Метод термической диссоциации для проведения селекции ДНК-аптамеров. Биоорг. химия. 2020;46(4):411–417. https://doi.org/10.31857/S0132342320040156Lapa S.A., Shershov V.E., Krasnov G.S., Volkova O.S., Kuznetsova V.E., Radko S.P., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. Method of terminal dissociation for the selection of DNA-aptamers. Bioorg. Khimiya = Bioorg. Chemistry. 2020;46(4):411–417 (in Russ.). https://doi.org/10.31857/S0132342320040156Gold L., Ayers D., Bertino J., Bock C., Bock A., Brody E.N., Carter J., Dalby A.B., Eaton B.E., Fitzwater T., Flather D., Forbes A., Foreman T., Fowler C., Gawande B., Goss M., Gunn M., Gupta S., Halladay D., Heil J., Heilig J., Hicke B., Husar G., Janjic N., Jarvis T., Jennings S., Katilius E., Keeney T.R., Kim N., Koch T.H., Kraemer S., Kroiss L., Le N., Levine D., Lindsey W., Lollo B., Mayfield W., Mehan M., Mehler R., Nelson S.K., Nelson M., Nieuwlandt D., Nikrad M., Ochsner U., Ostroff R.M., Otis M., Parker T., Pietrasiewicz S., Resnicow D.I., Rohloff J., Sanders G., Sattin S., Schneider D., Singer B., Stanton M., Sterkel A., Stewart A., Stratford S., Vaught J.D., Vrkljan M., Walker J.J., Watrobka M., Waugh S., Weiss A., Wilcox S.K., Wolfson A., Wolk S.K., Zhang C., Zichi D. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 2010;5(12):e15004. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015004Gold L., Ayers D., Bertino J., Bock C., Bock A., Brody E.N., Carter J., Dalby A.B., Eaton B.E., Fitzwater T., Flather D., Forbes A., Foreman T., Fowler C., Gawande B., Goss M., Gunn M., Gupta S., Halladay D., Heil J., Heilig J., Hicke B., Husar G., Janjic N., Jarvis T., Jennings S., Katilius E., Keeney T.R., Kim N., Koch T.H., Kraemer S., Kroiss L., Le N., Levine D., Lindsey W., Lollo B., Mayfield W., Mehan M., Mehler R., Nelson S.K., Nelson M., Nieuwlandt D., Nikrad M., Ochsner U., Ostroff R.M., Otis M., Parker T., Pietrasiewicz S., Resnicow D.I., Rohloff J., Sanders G., Sattin S., Schneider D., Singer B., Stanton M., Sterkel A., Stewart A., Stratford S., Vaught J.D., Vrkljan M., Walker J.J., Watrobka M., Waugh S., Weiss A., Wilcox S.K., Wolfson A., Wolk S.K., Zhang C., Zichi D. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 2010;5(12):e15004. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015004

The authors declare that there are no conflicts of interest present.